1、返回目录 DNA和蛋白质技术 专题5 返回目录 课题3 血红蛋白的提取和分离返回目录 学习要求 1.了解凝胶色谱法、电泳法等技术分离生物大分子的基本原理。2.掌握血红蛋白提取和分离的基本过程。返回目录 课前 教材预案课堂 深度拓展课末 随堂演练课后 限时作业目录Contents 返回目录 1凝胶色谱法(1)概念：也称作_，是根据相对分子质量的_分离蛋白质的有效方法。课前教材预案要点一 血红蛋白提取和分离的基本原理分配色谱法 大小 返回目录(2)原理由_构成的凝胶，内部有许多贯穿的_。微小的多孔球体 通道 返回目录 当_不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_
2、，移动速度_，而相对分子质量_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程_，移动速度_，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以_。相对分子质量 较小 较长 较慢 较大 凝胶外部 较短 较快 分离 返回目录 2缓冲溶液(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的_对溶液pH的影响，维持pH_。(2)配制：由12种_溶解于水中配制而成，通过_就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。酸和碱 基本不变 缓冲剂 调节缓冲剂的使用比例 返回目录 3电泳(1)概 念：指 _ 在 电 场 的 作 用 下 发 生_的过程。(2)原理：在一定的_下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上_或_，在电
3、场的作用下，这些带电分子会向着_的电极移动。带电粒子 迁移 pH 正电 负电 与其所带电荷相反 返回目录(3)作 用：电 泳 利 用 了 待 分 离 样 品 中 各 种 分 子_的差异及分子本身的_、_的不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中_。(4)方法：常用的电泳方法有_和_。测定蛋白质分子量时通常使用_。带电性质 大小 形状 迁移速度 各种分子的分离 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 返回目录 蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、_、纯化和_。要点二 血红蛋白提取和分离的实验操作与评价粗分离 纯度鉴定 返回目录 1样品处理及粗分离(1)红细胞的洗涤
4、：采集血样，低速短时间离心，吸取血浆后加_洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是_，以利于后续步骤的分离纯化。生理盐水 去除杂蛋白 返回目录(2)血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加入_至原血液体积，再加入40%体积的_，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，使红细胞吸水_，血红蛋白释放出来。(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到_中，以2 000 r/min的速度离心10 min，使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。蒸馏水 甲苯 破裂 离心管 返回目录(4)透析：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 m
5、L的物质的量浓度为20 mmol/L的_中(pH为7.0)，透析12 h(以除去样品中相对分子质量较_的杂质)。磷酸缓冲液 小 返回目录 2凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料加工橡皮塞安装_。(2)凝胶色谱柱的_。(3)样品的加入和_。色谱柱 装填 洗脱 返回目录 3操作提示(1)红细胞的洗涤：_、_与_十分重要。洗涤次数过少，无法除去_；离心速度_和时间_会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。(2)色谱柱填料的处理：商品凝胶在使用前需放在_ 中 膨 胀，为 了 加 速 膨 胀 可 以 进 行_。洗涤次数 离心速度 离心时间 血浆蛋白 过高 过长 洗脱液 沸水浴加热 返回目录(3)凝
6、胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有_ 存 在，因 其 能 搅 乱 洗 脱 液 中 蛋 白 质 的_，降低分离效果。(4)蛋白质的分离：如果_，说明色谱柱制作成功。气泡 洗脱次序 红色区带均匀一致地移动 返回目录 课堂深度拓展考点一 蛋白质提取与分离的原理和方法1原理：根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力，等等。返回目录 返回目录 2凝胶色谱法(分配色谱法)(1)凝胶：实际上是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖、琼脂糖。返回目录(2)原理：凝胶小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量较大的蛋
7、白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。返回目录 3凝胶电泳法(1)原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。返回目录(2)常见电泳方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
8、。返回目录【例题1】凝胶色谱法分离蛋白质依据的原理是()A蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小B蛋白质相对分子质量的大小C蛋白质所带电荷的多少D蛋白质溶解度的大小返回目录 思维导引：答案 B 返回目录 解析 凝胶色谱法所用的凝胶实际上是一些微小多孔的球体，在小球内部有许多贯穿的通道，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。返回目录【变式1】下列关于电泳的说法，不正确的是()A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C
9、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率仅取决于它所带净电荷的多少返回目录 D用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小答案 C 返回目录 解析 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素；SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。返回目录 考点二 血红蛋白的提取和分离实验的操作方法返回目录 1样品处理(1)红细胞的洗涤目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。过程：低速短时间离心吸出上层透明的黄色血浆下层红细胞液倒入
10、烧杯加五倍体积生理盐水缓慢搅拌10 min低速短时间离心重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色(表明红细胞已洗涤干净)。返回目录(2)血红蛋白的释放目的：使红细胞破裂，释放出血红蛋白。过程返回目录 2粗分离(1)分离血红蛋白溶液目的：使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。过程a离心：将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000 r/min的速度离心10 min。返回目录 b离心结果溶液分为4层第1层最上层：甲苯层无色透明第2层中上层：脂溶性物质沉淀层白色薄层固体第3层中下层：血红蛋白的水溶液层红色透明液体第4层最下层：杂质沉淀层暗红色返回目录 c分离血红蛋白溶液：将试管中液体用滤
11、纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。返回目录(2)透析目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质或用于更换样品的缓冲液。过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的烧杯中，透析12 h。返回目录 3凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端用砂纸磨平。柱底部制作：橡皮塞打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目的尼龙纱将橡皮塞上部包好。返回目录 柱顶部制作：橡皮塞打孔安装玻璃管。将上述三部分按相应位置组装成一个整体。安装其他
12、附属结构。返回目录(2)凝胶色谱柱的装填返回目录(3)样品的加入和洗脱(纯化)返回目录 4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)用途：判断纯化的蛋白质是否达到要求。(2)流程：安装电泳用玻璃板制备SDS聚丙烯酰胺凝胶处理样品固定凝胶加样电泳剥胶染色脱色观察结果。返回目录 5结果分析与评价项目分析血液样品的处理分层明显样品处理完成分层不明显的原因洗涤次数少，未能除去血浆蛋白离心速度过高，时间过长返回目录 项目分析凝胶色谱柱的装填放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查(加入大分子有色物质，如蓝色葡聚糖2 000或红色葡聚糖)色带均匀、狭窄、平整装填成功血红蛋白的分离血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液
13、缓慢流出分离成功返回目录【例题2】在蛋白质的提取和分离中，对于样品的处理过程的分析正确的是()A洗涤时离心速度过高，时间过长，白细胞等会发生沉淀，达不到分离的效果B洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐C洗涤过程中用0.1%的生理盐水D透析的目的是除去样品中相对分子质量较大的杂质返回目录 思维导引：答案 A 返回目录 解析 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白；洗涤过程中要用生理盐水(质量分数为0.9%的NaCl溶液)；而透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。返回目录【变式2】在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲溶液，其作用主要是()A使酶的活性最高B使蛋白质的活性最高C维持蛋白
14、质所带的电荷D使蛋白质带上电荷答案 C 返回目录 解析 蛋白质具有两性，在一定pH下，蛋白质分子的某些基团会带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。因此，加缓冲溶液的目的是维持蛋白质所带的电荷，而不是使蛋白质带上电荷。返回目录 1蛋白质的提取和分离分为哪几步()A样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳B样品处理、凝胶色谱操作、纯化C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定课末随堂演练
15、返回目录 答案 C 解析 蛋白质提取和分离的实验步骤一般包括样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定4步。返回目录 2仔细观察下图，所带负电荷最少的球蛋白是()A1球蛋白 B2球蛋白C 球蛋白 D 球蛋白答案 D 返回目录 解析 对于题图中几种球蛋白来说，直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少。由点样的位置可知，球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且球蛋白距点样处最近，所以球蛋白所带负电荷最少。返回目录 3以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理的叙述，错误的是()A红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的生理盐水，重复洗涤3次B将血红蛋白溶液放在质量分数为0.9%的NaCl溶液中透析12小时返回
16、目录 C凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在D将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离答案 B 返回目录 解析 红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的生理盐水，重复洗涤3次，目的是除去杂蛋白；透析时使用物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，而不是用0.9%的NaCl溶液；在装填凝胶柱时，不能有气泡存在，否则会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。返回目录 4下列关于红细胞洗涤过程的叙述，正确的是()A低速长时间离心，如500 r/min,12 min，以保证达到很好的分离效果B离心后用胶头吸管吸出下层透明的红色血浆C将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入5倍体积的蒸馏水D直至
17、上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净返回目录 答案 D 解析 红细胞洗涤过程中，应做低速短时间离心，以避免白细胞、淋巴细胞等一同沉淀，影响血红蛋白的提纯；离心后血浆在上层，并呈现为黄色，需用胶头吸管吸出；洗涤红细胞时应用生理盐水而不用蒸馏水，否则将导致红细胞破裂影响实验结果。返回目录 5凝胶柱制作的顺序一般是()橡皮塞打孔 挖凹穴 装玻璃管 盖尼龙网 盖尼龙纱 将橡皮塞插入玻璃管 接尼龙管、装螺旋夹 柱顶安装带玻璃管的橡皮塞ABCD返回目录 答案 B 解析 凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管选择合适的橡皮塞打孔挖凹穴安装玻璃管盖尼龙网盖尼龙纱将橡皮塞插入玻璃管接尼龙管装螺旋夹柱顶安装带玻璃管
18、的橡皮塞。返回目录 6如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：返回目录(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。(2)甲 装 置 中，B 是 血 红 蛋 白 溶 液，则 A 是_；乙 装 置 中，C 溶 液 的 是 作 用 是_。返回目录(3)甲装置用于_，目的是_；用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法。(4)用 乙 装 置 分 离 血 红 蛋 白 时，待_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。返回目录 解析(1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是磷酸缓冲液；乙装置中，C溶液的作用是洗脱血红蛋白。(3)甲装置用于透析(粗分离)，目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质；用乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。(4)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。返回目录 答案(1)运输(2)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白(3)透析(或粗分离)去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端返回目录 课后限时作业
