1、理解教材新知把握命题热点应用落实体验课下综合检测 课堂回扣练习 命题点一 命题点二 知识点一 知识点二 12 基因工程的基本操作程序 专题1 命题点三 知识点三 12基因工程的基本操作程序1基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。2获取目的基因的常用方法有：从基因文库中获取和利用PCR技术扩增。3基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因。4将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。5培育转基因动物时，受体细胞一般是受精
2、卵，目的基因的导入方法常用显微注射技术。6检测目的基因是否导入和转录，常用分子杂交技术；检测是否翻译，常用抗原抗体杂交技术。目的基因的获取1目的基因(1)主要是指_的基因。(2)也可以是一些具有_的因子。编码蛋白质调控作用2获取方法(1)从基因文库中获取：基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多_，导入_的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。DNA片段受体菌(2)利用PCR技术扩增目的基因：原理：_。前提：有一段已知目的基因的_，以便根据这一序列合成_。条件：DNA模板、_、_和4种脱氧核苷酸。DNA复制核苷酸序列引物引物热稳定DNA聚合酶过程：(3)人工合成法：条件：基因
3、比较小，_又已知。方法：通过_用化学方法直接人工合成。核苷酸序列DNA合成仪1探讨基因文库、基因组文库、cDNA文库之间的关系。提示：基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库只含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库。2PCR过程中，需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？提示：PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。1获取目的基因方法的比较方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)过
4、程供体细胞中的 DNA限制酶许多DNA片段连接表达载体 导入受体细胞外源 DNA 扩增，产生特定性状分离目的基因目的基因的mRNA 反转录单链DNA合成双链DNA插入载体导入受体菌群(cDNA文库)分离目的基因目的基因DNA高温解链单链DNA与引物结合、DNA聚合酶大量目的基因蛋白质的氨基酸序列 推测mRNA的核苷酸序列 推测基因的核苷酸序列化学合成目的基因方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)优点操作简单专一性强可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高需要严格控制温
5、度、技术要求高适用范围小2PCR技术与生物体内DNA复制的比较DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐热的DNA聚合酶(Taq聚合酶)温度条件细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行合成的对象DNA分子DNA片段或基因DNA复制PCR技术联系模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成原料：均为四种脱氧核苷酸酶：均需要DNA聚合酶进行催化引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸特别提醒(1)基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利
6、于基因的表达。(2)通过 cDNA 文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。(3)热稳定 DNA 聚合酶(Taq 聚合酶)能在高温下保持其活性，是 PCR 技术关键的工具之一。基因表达载体的构建和目的基因的导入1基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的目的：使目的基因在_中稳定存在，并且可以_给下一代；使目的基因能够_和_。受体细胞遗传表达发挥作用(2)基因表达载体组成：2将目的基因导入受体细胞(1)导入植物细胞的方法：农杆菌转化法原理：农杆菌Ti质粒上的_可整合到受体细胞的染色体DNA上适用范围：主要适用于_和_：常用于单子叶植物。花粉管通道法：目的基因借助花粉管
7、通道进入受体细胞。裸子植物双子叶植物T-DNA基因枪法花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。(2)导入动物细胞：方法：_技术。常用受体细胞：_。(3)导入微生物细胞：原核生物特点：_、多为_、遗传物质相对_等。方法：感受态细胞法，即用_处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为_)。显微注射受精卵繁殖快单细胞较少Ca2感受态细胞1基因表达载体的构建需要哪些工具酶？提示：限制酶、DNA连接酶。2为什么植物的体细胞可以作为受体细胞，而动物的体细胞不能作为受体细胞？提示：植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可
8、以是体细胞；动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体，因此动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。提示：不可以。糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。3从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？1基因表达载体的构建过程将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示：2将目的基因导入受体细胞的方法比较生物类型植物动物微生物受体细胞体细胞受精卵原核细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显
9、微注射技术感受态细胞法生物类型植物动物微生物转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的TDNA上转入农杆菌中导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上提取含目的基因的表达载体显微注射受精卵发育具有新性状的个体Ca2处理细胞感受态细胞基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子目的基因的检测与鉴定1分子水平的检测连线2个体水平的鉴定(1)_的接种实验。(2)对基因工程产品与天然产品的功能进行_。抗虫或抗病活性比较1检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。2DNA分子杂交的原理是什么？有哪些应用？提示：碱基互补配对原则。可用于亲
10、子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关系鉴定等。1目的基因的检测与鉴定归纳2不同分子检测的原理、场所、探针的异同(1)进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物的细胞内的mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。(2)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。(3)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。以流程图为载体，考查目的基因的获取方法例1 为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻
11、，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图回答：(1)图中基因组文库_(填“小于”“等于”或“大于”)cDNA文库。(2)B过程需要的酶是_；A、C过程中_(填“可以”或“不可以”)使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。(3)目的基因和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中_和_为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是_。精讲精析 分析获取植酸酶基因的流程图可知，图中基因组文库大于cDNA文库。B过程需要的酶应该是逆转录酶；A、C过程虽然都能获得含目的基因的菌株，但C中无内含子对应的序列，所以不可以使用同一种探针进行筛选。目的基因和除可从构建的文库中分离外，还
12、可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。答案(1)大于(2)逆转录酶 不可以(3)DNA cDNA 耐高温1真核细胞基因结构(1)结构编码区：内含子、外显子非编码区：启动子、终止子(2)表达：只有编码区能转录生成RNA，且内含子转录的部分要剪切掉，即转录生成的mRNA只有外显子对应部分。因此，以mRNA为模板，逆转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。2启动子、终止子和起始密码子、终止密码子的区别(1)启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单
13、位都是脱氧核苷酸。(2)起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。1下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是()AcDNA文库中的DNA来源于mRNA的反转录过程B如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同CcDNA文库中的基因都没有启动子D一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种解析：由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以mRNA反转录成的DNA就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编码区段，和原来的基因结构不相同。答案：B
14、以模式图为依托，考查基因表达载体的构建例2 右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR、BamH的酶切位点，ampr为青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR、BamH在内的多种酶的酶切位点。据图回答：(1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_、_、_三种。(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有
15、_；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有_。(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是_，其合成的产物是_。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。思路点拨精讲精析(1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR酶切，所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物：目的基因目的基因、目的基因运载体、运载体运载体。(2)在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培养基上生长，只有运载体运载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。(3)启动子是RNA聚合酶识别
16、和结合的位点，可启动转录过程，合成mRNA。(4)由图示和题目中提供的信息可知，同时运用EcoR和BamH进行酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。答案(1)目的基因载体连接物 载体载体连接物 目的基因目的基因连接物(2)载体载体连接物 目的基因载体连接物、载体载体连接物(3)启动子 mRNA(4)EcoR和BamH以过程图为载体，综合考查对基因工程的理解例3 科研人员研究发现，一种植物激素油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因(如P450)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物
17、质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请据图回答：(1)获得油菜素内酯基因的方法有_、_(举两种即可)。第步用PCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指_。步骤用到的酶有_。(2)图中导入重组质粒的方法是_。在导入之前应用_处理。(3)导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用_制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养基中加入_可将含有目的基因的细胞筛选出来。(4)请你为该课题命名：_。思路点拨精讲精析 进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从基因文库中获取、人工合成或PCR合成等。在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和
18、DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，故可用转化法导入表达载体，导入后，需检测和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检测转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。答案(1)从基因文库中获取 人工合成或PCR合成 耐热的DNA聚合酶 限制酶和DNA连接酶(2)转化法 氯化钙溶液(3)红霉素抗性基因 红霉素(4)油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解(1)原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。(2)基因工程“四步曲”中，只有第3步“将目的基因导入受体细胞”没有发生碱基互补配对，其他三步都涉及碱基互补配对，如第1步发生在反转录法合成目的基因的过程中；第2步发生在黏性末端相互连
19、接配对的过程中；第4步发生在目的基因的导入检测、转录检测过程中。(3)Ca2促进转化的原因：Ca2(或CaCl2溶液)对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。22013年3月在上海和安徽首次发现H7N9禽流感病例，现在我国多地出现禽流感疫情，为此某研究小组为了研制预防H7N9禽流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下图。下列有关叙述错误的是()禽流感病毒 提取 RNA DNA 选择性扩增Q基因 携带Q基因的重组质粒 导入大肠杆菌 表达Q蛋白 A步骤所代表的过程是反转录B步骤需使用限制酶和DNA连接酶C步骤可用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其从感受态恢复到常态D检验Q蛋白的免疫反
20、应特性，可用Q蛋白与患禽流感康复的鸡的血清进行抗原抗体特异性反应实验解析：CaCl2溶液处理大肠杆菌的目的是使其从常态转化为感受态。答案：C 课堂回扣练习1基因工程的基本操作程序有：使目的基因与运载体相结合；将目的基因导入受体细胞；检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；提取目的基因。正确的操作顺序是()A BCD解析：基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定。答案：C 2下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成ABCD解析：PC
21、R利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法则是以目的基因转录成的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。答案：D、均不需要模板。3下列关于基因表达载体的构建描述错误的是()A基因表达载体的构建是基因工程的核心B基因表达载体的构建包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分C目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因D构建的基因表达载体都是相同的解析：基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一个基因表达载体的组成除目的基因外还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是
22、指编码蛋白质的结构基因；由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差别，不可能都是相同的。答案：D 4(天津高考)为达到相应目的，必须通过分子检测的是()A携带链霉素抗性基因受体菌的筛选B产生抗人白细胞介素-8抗体的杂交瘤细胞的筛选C转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定D21三体综合征的诊断解析：可通过向普通培养基中添加链霉素来检测受体菌是否表现链霉素抗性，从而达到筛选携带链霉素抗性基因受体菌的目的；通过专一抗体检验阳性来筛选产生抗人白细胞介素-8抗体的杂交瘤细胞，采用抗原抗体杂交方法，必须通过分子检测；通过做抗虫接种实验，可确定转基因抗虫棉植株是否具有抗性以及抗性程度，这是个体生物学水平的鉴定；2
23、1三体综合征是染色体异常遗传病，可通过观察细胞中染色体的数目来检测，属于细胞水平检测。答案：B 5下图是利用基因工程方法培育抗虫棉的过程。请回答相关问题：(1)从苏云金芽孢杆菌的DNA上获取抗虫基因，需要用到的工具是_，此工具主要是从_生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的_键断开。(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有_，它能把目的基因整合到受体细胞的_上。(3)E过程是利用植物组织培养技术完成的，要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做_实验。(4)将目的基因导入植物细胞，除采用上图中的方法外，还可以采用_法和花粉管通道法。解析：(1)限制酶用于切割DNA分子，获取目的基因。限制酶主要从原核生物细胞中获取。限制酶可使磷酸二酯键断裂，将DNA分子切开。(2)Ti质粒是可转移DNA，其上T-DNA可以整合到植物细胞的染色体DNA上，故将目的基因借助Ti质粒导入植物细胞中。(3)把害虫接种到转基因植株上，以检测转基因植株的抗虫基因是否正常表达。答案：(1)限制酶 原核 磷酸二酯(2)TDNA 染色体DNA(3)抗虫的接种(4)基因枪
