1、选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 生物技术实践第 37 讲 DNA和蛋白质技术选修1 选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 1进行DNA的粗提取与鉴定。2尝试PCR技术的基本操作和应用。3尝试蛋白质的提取和分离。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 1(2010江苏)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20、另一组置于20 条件下保存24 h。DNA粗提取：第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 第二
2、步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮状物。DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术(注：“”越多表示蓝色越深)分析上述实验过程，回答下列问题：(1)该探究性实验课题名称是 。(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少 。探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响DNA断裂选修1第37讲
3、 DNA和蛋白质技术(3)根据实验结果，得出结论并分析。结论1：与20 相比，相同实验材料在20 条件下保存，DNA的提取量较多。结论2：。针对结论1，请提出合理的解释：。(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢将第三步获得的溶液分别与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液选修1第37讲 DNA和蛋白质技
4、术 本题考查了DNA粗提取技术的原理、操作过程及学生的分析、判断能力。从题目实验看出，该实验的课题名称是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。在实验的第二步中，为了防止DNA断裂，要缓缓地搅拌。从表中结果看出，由于低温抑制了相关酶的活性，DNA降解慢，使得相同材料在低温保存时，DNA提取量大；在相同保存条件下，蒜黄蓝色最深，说明相同条件下从蒜黄中提取的DNA量最大。由于氯仿密度比水大，可使蛋白质变性后沉淀，而与水、DNA不相溶，这样可将第三步获得的溶液分别与等量的氯仿混合，静置一段时间，吸取上清液即可得到较纯净的DNA。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 2.(2008山东)科学家发
5、现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的 ，大小及性状不同，在电场中的 不同而实现分离。电荷(带电情况)迁移速度选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 (2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白质的体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 和 。(3)分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两种培养基中菌落的 ，确定该蛋白质的抗菌效果。(4)抗 菌 培 养 常 用 的 接 种 方 法 有 .和 。实验结束后，对使用过的培养基应进行 处理。碳源氮源数量平
6、板划线法稀释涂布平板法(稀释混合平板法)灭菌选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 (1)电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、蛋白质、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 (2)牛肉膏和蛋白胨是成分复杂的天然有机物，能为微生物提供碳源、氮源。(3)可采用逆向思维。若抗
7、菌蛋白具有抗菌效果，即抗菌蛋白抑制了金黄色葡萄球菌的生长繁殖，则不形成菌落或菌落数量明显偏少。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 (4)微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释。然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是防止造成环境污染。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 一、DNA的粗提取与鉴定 1.原理粗提取DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的N
8、aCl溶液中溶解度不同。在0.14 mol/L 的NaCl溶液中DNA溶解度最.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精DNA与杂质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同鉴定DNA+蓝色二苯胺沸水浴5 min低选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 2.粗提取流程(以鸡血细胞液做实验材料为例)选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 3.鉴定序号试管A试管B2 mol/L 的NaCl溶液5 mL5 mL加丝状物，用玻璃棒搅拌加二苯胺4 mL，混匀4 mL，混匀沸水浴5 min5 min实验现象变蓝不变蓝实验结论丝状物的主要成分是DNA分子选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 本实验不能用哺乳动物的成熟
9、红细胞作实验材料，原因是哺乳动物的成熟红细胞内无细胞核，但它可作为血红蛋白提取和制备细胞膜的理想材料。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 体内复制PCR反应解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90，双链全部解开，不需解旋酶温度体内温和条件高温引物一小段RNARNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 二、多聚酶链式反应扩增DNA片段1.生物体内DNA复制与PCR反应的比较选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 体内复制PCR反应特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增酶解旋酶、DNA聚合酶等Ta
10、qDNA聚合酶循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，子链延伸的方向都是从5端3端选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 条件稳定的缓冲液环境；DNA模板；分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物；A、T、G、C四种脱氧核苷酸；耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；能严格控制温度变化的温控设备过程变性：当温度上升到90 以上时，双链DNA解 旋为单链复性：温度下降为50 左右时，两种引物通过碱 基互补配对与两条单链DNA结合延伸：当温度上升到72 左右，四种脱氧核苷酸 在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配 对原则合成新
11、的DNA链2.PCR反应选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 蛋白质分离的方法 三、血红蛋白的提取和分离 1.蛋白质分离的方法凝胶色谱法电泳法选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 蛋白质相对分子质量大相对分子质量小运动方式排阻在凝胶颗粒外面，迅速通过进入凝胶颗粒内部，被滞留移动速度 .运动路程较短较长洗脱次序先后凝胶色谱法较快较慢选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 原理:一些生物大分子(如多肽、核酸等),在一定pH下，其可解离的基团会带 上正电或负电,在电场的作用下,这些 带电分子会向着与其所带电荷 的 电极移动影响因素:各种分子带电性质的差异以及 分子本身的大小、形状常用方法:琼脂糖凝胶电泳和聚
12、丙烯酰胺 凝胶电泳(通常使用 聚丙 烯酰胺凝胶电泳)电泳法相反SDS选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 步骤目的过程样品处理红细胞洗涤去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化分离(低速短时间离心)用胶头吸管吸去上层透明黄色血浆下层红色细胞用 洗涤(低速短时间离心)三次血红蛋白的释放使红细胞破裂释放血红蛋白 依图中abcd顺序2.蛋白质的提取和分离操作流程生理盐水选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 步骤目的过程样品处理分离血红蛋白经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化搅拌好的混合液转移至离心管中，2000 r/min速度离心10 min(高速长时间)滤纸过滤除去杂质得血红蛋
13、白粗分离(透析)除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品的缓冲液1 mL 血红蛋白溶液透析袋 20 mmol/L 的 (pH为7.0)12h装入放入透析磷酸缓冲液选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 步骤目的过程纯化凝胶色谱柱制作通过凝胶色谱操作，根据 .分离蛋白质(将相对分子质量大的杂质蛋白除去)取玻璃管制作柱底部制作柱顶部凝胶色谱柱的装填固定色谱柱计算所需凝胶量凝胶用蒸馏水溶胀装填洗涤平衡样品的加入和洗脱调整缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床洗脱收集相对分子质量的大小选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 步骤目的过程纯度鉴定判断纯化的蛋白质是否达到要求使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(操作
14、选做)选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的容易进入凝胶内部的通道，而相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，移动速度快，因此相对分子质量不同的蛋白质分子彼此分离。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 1.如何正确区分破碎动物细胞和植物细胞的原理和方法？原理方法动物细胞(鸡血细胞)在低浓度溶液中会吸水甚至涨破鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液植物细胞(洋葱细胞)洗涤剂能够瓦解细胞膜在切碎的洋葱中，加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 2.教材中去除滤液
15、中杂质的三种方案有什么不同？原理方法方案一DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同在滤液中加入2 mol/L NaCl溶液，过滤除去不溶杂质；再调节NaCl溶液浓度为0.14 mol/L，析出DNA，过滤除去不溶的杂质，再用2 mol/L NaCl溶液溶解DNA选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 原理方法方案二DNA对酶的耐受性直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015 min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质方案三DNA对高温的耐受性将滤液放在6075 的恒温水浴箱中保温1015 min，注意严格控制温度范围，使蛋白质沉淀而DNA分子还未变性，可将DNA与蛋白质分离选修1第37讲 DNA和蛋白
16、质技术 3.如何区分DNA粗提取实验中部分操作的目的？加蒸馏水加到鸡血细胞液，使血细胞吸水胀裂加到含DNA的2 mol/L NaCl溶液，使DNA析出用纱布过滤过滤血细胞破裂液，提取细胞核物质(滤液)滤取0.14 mol/L NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)过滤溶有DNA的2 mol/L NaCl溶液(滤液)选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 用NaCl溶液加2 mol/L NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质(加蒸馏水)0.14 mol/L NaCl溶液使DNA析出加2 mol/L NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物用2 mol/L NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA选修1第37讲
17、DNA和蛋白质技术 4.什么是3端和5端？DNA复制为什么需要引物？为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而含磷酸基团的末端称为5端；一个双链DNA分子中含2个3端和2个5端，如果一条链的方向是35，则另一条链的方向就是53，这就是反向平行的含意。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。PCR实验中，引物长度通常为2030个核苷酸。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 5.PCR实验中应注意哪些问题？如何进行PCR结果的分析与评价？(1)PCR实验中的注意事项：避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前进行高压灭菌。缓冲液和酶分装成小
18、份，-20 低温保存。每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 (2)PCR结果的分析与评价：对于教材中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。过程：稀释对照调零测定计算。对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。扩增不成功的可能原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 6.分离血红蛋白的样品处理中，红细胞洗涤
19、时为什么要低速短时间离心，并且要洗涤三次？红细胞洗涤时，洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一起沉淀，达不到分离的效果。洗涤三次后，若上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 7.凝胶色谱柱的装填有什么要求？如何进行样品的加入和洗脱？在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不能有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需
20、要重新装填。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。根据红色区带的移动状况判断收集流出液时间，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL 收集一管，连续收集。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 DNA的粗提取与鉴定 下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中，所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是()试剂操作作用A柠檬酸钠溶液与鸡血混合防止DNA受损B蒸馏水与鸡血细胞混合保持细胞形状C蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶
21、液中析出DNA丝状物D冷却的酒精加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中产生特定的颜色反应C选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 在“DNA粗提取与鉴定”实验中柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜破裂；DNA在不同的氯化钠溶液中的溶解度不同，在0.14 mol/L 时，溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些物质可以溶于酒精，所以加入酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺产生蓝色反应(需要沸水浴加热)。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 在“DNA粗提取与鉴定”的实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL 的四种溶液中，经搅拌后过滤，获得4
22、种滤液，含DNA较少的是()A.B.C.D.C1 蒸馏水中搅拌后过滤 滤液E2 2 mol/L 的NaCl溶液搅拌后过滤 滤液F3 0.14 mol/L 的NaCl溶液中搅拌后过滤 滤液G4 冷却的95%的酒精溶液中 搅拌后过滤 滤液H选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L 的NaCl溶液中溶解度最低，参照DNA在NaCl溶液中溶解度曲线，可知中只有滤液G中DNA含量较少。DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可以将DNA与蛋白质进一步分离，可见滤液H中DNA也较少。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术
23、DNA与蛋白质的溶解性不同：溶解规律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白质NaCl溶液浓度从2 mol/L降低过程中，其溶解度逐渐增大部分发生盐析沉淀溶解选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 多聚酶链式反应扩增DNA片段 关于DNA的复制，下列叙述正确的是()A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链 B.DNA复制不需要引物 C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合 D.DNA的合成方向总是从子链的3端向5端延伸C选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端即复制方向由3端向5端延伸；由
24、于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5端向3端延伸。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 下图示PCR技术扩增获取DNA的过程。扩增时首先使DNA两条链解开为单链；然后冷却使“引物”(DNA复制时所需的约20个核苷酸的短链)与单链相应碱基互补序列结合；再在热稳定DNA聚合酶的作用下进行延伸，合成与模板互补的DNA新链，如此反复循环。上述过程可在PCR扩增仪中自动完成。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 (1)图中过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达9095 时才能完成，说明DNA分子具有 性。(2)过 程 在 人 体 内 可 由
25、 .催化完成。(3)由题中信息可知，在PCR扩增仪中进行DNA自动扩增时，若起始时有a个DNA分子，连续扩增n代，可形成 个DNA分子。稳定DNA聚合酶(DNAa2n聚合酶、DNA连接酶)选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 DNA比蛋白质更能忍受高温，分子结构具有相对的稳定性，其中GC碱基对占比例越高的DNA分子越稳定。为延伸过程，在体外扩增是耐高温的DNA聚合酶催化，在体内是由DNA聚合酶催化完成。依据起始a个以及DNA扩增呈指数增长，可得答案。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 血
26、红蛋白的提取和分离 蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是()A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离 B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质 C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质 D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质A选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 A项蛋白质分子既然不能透过半透膜，那样品中的各种不同的蛋白质仍在透析袋内，而不能达到分离的目的。B正确：电泳利用了分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，
27、从而实现样品中各种分子的分离。C正确：凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。D正确：根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质，分子大、密度大的在沉淀物中。选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 下列叙述错误的是()A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变 B.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 C.洗涤红细胞时，用五倍体积的蒸馏水充分冲洗 D.缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成C选修1第37讲 DNA和蛋白质技术 洗涤红细胞时，应是加入五倍体积的生理盐水，以维持红细胞的正常形态和结构。血液样品处理后，若分层不明显，原因有：洗涤次数少，未能除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长。
