1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段1理解PCR的原理。(重点)2体验PCR这一常规的分子生物学实验的方法。(难点)3了解PCR的应用。(重点)PCR 扩 增 的 原 理 和 过 程1细胞内DNA复制过程的解析解旋：在解旋酶作用下，DNA两条链打开，形成两条DNA单链引物结合：在DNA单链3端，通过碱基互补配对与DNA母链结合DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始子链合成：DNA聚合酶从引物3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来后续加工：将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来，子链和母链再形成双螺旋结构2PCR技术的原理(1)PC
2、R技术：即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)子链扩增：需要引物，合成方向总是从子链的5端向3端延伸。(3)解旋原理：DNA的热变性原理。在80100_的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。(4)条件模板：DNA的两条链。引物：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。原料：A、T、G、C四种脱氧核苷酸。酶：耐热DNA聚合酶，一般用耐高温的TaqDNA聚合酶。其他条件：需要一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控
3、设备。3PCR技术的过程(1)变性当温度上升到90 以上时，双链DNA解旋为单链。(2)复性温度下降到50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸温度上升到72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。探讨：什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。探讨：PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？提示：不需要。探讨：PCR
4、技术中需要的两种引物碱基序列相同吗？为什么？提示：不同。由于DNA两条模板链中碱基序列并不相同，引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此DNA两条模板链在进行扩增时，需要的引物碱基序列是不同的。生物体内的DNA复制与PCR反应的比较体内DNA复制PCR反应不同点时期细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期体外随时进行场所活细胞内微量离心管内酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)解旋在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90 以上时，双链全部解开，不需解旋酶不同点引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链
5、不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72 左右特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30多次产物完整DNADNA片段相同点原料4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)复制原理严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制模板以DNA母链为模板引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物1下列有关PCR的描述，不正确的是()A是一种酶促反应B反应需要引物C扩增产量按y(1x)n计算D扩增对象是氨基酸序列【解析】PCR是一种需要耐热DNA聚合酶参与的，且需要引物的酶促反应，与细胞内DNA复制不同的是，整个过程中温度是变化的。PCR扩增的对象是DNA序列。故选D。【答案
6、】D2多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95 下变性(使模板DNA解旋)55 下复性(引物与DNA模板链结合)72 下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述不正确的是()A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的C延伸过程中需要DNA聚合酶和四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高【解析】变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链
7、结合；延伸是形成新的DNA分子的过程，需要以四种脱氧核苷酸为原料；PCR过程的温度高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温DNA聚合酶。【答案】C3有关PCR技术的下列叙述，不正确的是()A聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术B在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似CPCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸即可DPCR一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段【解析】PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚
8、合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。【答案】CPCR 的 实 验 操 作 及 操 作 提 示1实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。2实验操作程序准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液混合均匀离心：将微量离
9、心管放在离心机上，离心约10 s。目的是使反应液集中在离心管底部反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应3实验操作注意事项(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20_储存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。4DNA含量的测定(1)原理：利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。(2)计算公式：DNA含量(g/mL)50(260_nm的读数)稀释倍数。探讨：PCR循环过程中，变性温度设置95 ，时间设置30 s的原因是什么？提示：变性温度过低
10、，解旋不完全导致DNA不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。探讨：在PCR过程中，延伸的温度为什么控制在72 ？提示：在72 左右时，Taq DNA聚合酶活性最高。在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA链。1DNA含量的测定DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下： 2PCR技术的应用(1)医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。(2)对单细胞中的DNA进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的DNA片段供遗
11、传病患者基因治疗时使用。(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定。(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。(5)在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。3PCR过程用到的重要仪器及其作用PCR仪能够自动调控温度来控制DNA双链解聚和结合的仪器，是PCR过程的核心仪器微量移液器用来按照配方向微量离心管分别精确加入PCR所需要的缓冲液、模板、引物、原料、酶等反应成分的仪器微量离心管实际上PCR反应进行的场所离心机可将离心管中的溶液经离心后集中在离心管底部，便于在PCR仪中进行反应紫外分光光度计可对PCR的反应结果的样品进行DNA含量的测
12、定(DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰)1 PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器，对PCR过程中“温度的控制”的说法错误的是() 【导学号：05520038】A酶促反应需要高的温度，是为了确保模板是单链B延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度CDNA聚合酶具有耐高温的能力DDNA解旋酶具有耐高温的能力【解析】PCR是体外DNA扩增，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性，双链螺旋结构解体，双链分开，在复性后，在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA，因此延伸的温度要大于复性温度而小于变性温度。【答案】D2在遗
13、传病及刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：(1)在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。(3)若将作为原料的4种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：_，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为_。(4)PCR反应过程的前提条件是_，PCR技术利用DNA的_原理解决了这个问题。(5)在对样品DNA进行分析的过程中
14、发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是_。【解析】(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，所以引物就提供了3端，子链延伸方向为53，引物与b链部分碱基互补，引物则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3端，故引物的结构为5GAOH，复性结果为：HOAG5 5GGTC3(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物和引物。(3)由于作为原料的4种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA中各有一条链含32P，若复制n次，共产生子链2n2，其中只有DNA母链不含32P，则其所占比例为2/(2n2)1/2n。(4)
15、DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。因此，首先要解旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对原则把相应的碱基一个个地连接起来。DNA分子在80100 的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。(5)DNA中杂质蛋白的去除可利用酶的专一性，加入蛋白酶。【答案】(1)5GAOHHOAG55GGTC3(2)3CCAG55GGTC35GGTC33CCAG5(3)每个DNA分子各有一条链含32P1/2n(4)DNA解旋热变性(5)蛋白酶1PCR技术扩增DNA，需要的条件是()目的基因引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等mRNA核糖体ABC D【解
16、析】PCR技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料。【答案】A2PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A BC D【解析】PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为2030个核苷酸。(2)PC
17、R过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。【答案】C3下图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的()A BC D【解析】因为PCR的反应过程需要引物，在第二轮循环过程中，a、d的引物分为、，无引物的为模板链(即、)，则b、c的模板链分别为、。故选D。【答案】D4下列关于操作过程的叙述，错误的是()APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试
18、剂后，移液器上的枪头都必须更换【解析】在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C项错误。故选C。【答案】C5标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()A95 、55 、72 B72 、50 、92 C50 、92 、72 D80 、50 、72 【解析】当温度上升到90 (9096 )以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 (4060 )左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度上升到72 (7075 )时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。【答案】A课堂小结：网络构建核心回扣1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，因此，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。2PCR反应需要DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。3PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。4PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步，对应的温度分别为95 、55 和72 。5DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列。6PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。
