1、基因工程及其应用1.课本102页2.基因工程：又叫基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向改造生物遗传性状。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程原理、实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切 拼接 导入 表达基因重组转基因西红柿3.基因工程应用转基因超级鼠善假于物也一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶1.名称：限制性核酸内切酶，又称限制酶。切割是在DNA分子内部进行，所以称为内切酶。2.来源：主要从原核生物中分离纯化出来。广泛分布在微生物中。迄今已从
2、近300中微生物中分离出了约4000种限制酶。识别双链DNA 中的特定的核苷酸序列，并且能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。特异性3.作用:大多限制酶识别序列由6个核苷酸组成。少数限制酶识别序列由4.5或8个核苷酸组成。重播大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。（切割点在中轴线的两侧。）4.结果：产生黏性末端或平末端。1.什么叫黏性末端？在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条链分别切开，产生的是黏性末端。2.什么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。3.要想获得某个
3、特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。4.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。5.限制酶是一类酶还是一种酶?限制酶是一类酶，不是一种酶?基因的针线DNA连接酶切断的DNA片段要与受体细胞的DNA连接，你觉得可以用什么酶？二.DNA连接酶“分子缝合针”1.名称：DNA连接酶2.作用实质：使两个DNA的单链末端之间形成磷酸二酯键。而连接成一个DNA。基因的针线：DNA连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T C
4、C T T A A GG C T T A AA A T T CGG C T T A AA A T T CGG C T T A AA A T T CG同种限制酶切割3.类型：根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：.从大肠杆菌中分离得到：E.coliDNA连接酶.从T4噬菌体中分离到：T4DNA连接酶.不同：E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接。T4DNA连接酶.既可以“缝合”双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低4.作用比较相同：均是将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。5
5、.DNA连接酶与DNA聚合酶的关系 共同点：二者的化学本质都是蛋白质。不同点：（1）DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端的羟基上，形成磷酸二酯键。（2）DNA连接酶是将DNA双链上的两个切口同时连接起来，不需要模板。DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链。基因进入受体细胞的载体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入细胞的工具就是载体。三、“分子运输车”运载体1.作用：2.常用运载体：将外源基因送入受体细胞
6、。质粒3.质粒的特点:裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且有自我复制能力的小型环状DNA分子。4.其他载体：噬菌体的衍生物和动植物病毒等5.作为载体的必备条件能够在宿主细胞中复制并稳定地保存具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。对受体细胞无害对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命，不影响受体细胞正常的生命活动。活动。基因的运输工具运载体能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。1.基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因表达与检测2
7、、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键切割目的基因和质粒的限制酶是同一种酶。注意目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带
8、进去。目的基因首段必须有启动子，尾端必须有终止子。目的基因单独导入受体细胞即使成功，也不能转录和翻译。转基因植物转基因动物：转基因产物：受精卵体细胞受精卵微生物细胞病毒真核：真菌（酵母菌、霉菌等）原核：细菌、放线菌、支原体等微生物4.受体细胞的选择第四步、目的基因的表达和检测 大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物(四)目的基因的表达与检测检测导入检测：目的基因是否导入受体
9、细胞方法 DNA分子杂交表达检测转录检测分子杂交翻译检测抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定一、基因工程与作物育种抗虫害的玉米转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄获得高产、稳产和具有优良品质的农作物和具有抗逆性的作物新品种。抗虫的基因来自苏云金杆菌。苏云金杆菌形成的伴胞晶体是一种毒性很强的蛋白晶体，能使棉铃虫等鳞翅口害虫瘫痪致死。科学家将编码这个蛋白质的基因导人作物，使作物自身具有抵御虫害的能力。生长快、肉质好的转基因鱼(中国)乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)2、基因工程与药物研制我国生产的部分基因工程疫苗和药物 许多药品的生产是从生物组织中提取的。
10、受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了50%-80%!3、环境保护基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化
11、汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。基因诊断：也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。探针制备：放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子；原 理：利用DNA分子杂交原理；五、基因治疗曙光初照 基因探针：基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。知识延伸DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
