1、第17讲 基因工程和细胞工程1(2019沈阳三模)2018年11月26日，基因编辑婴儿在中国出生。随着这一消息发布，基因编辑技术在争议中走进了人们视线。向导RNA和Cas9蛋白是基因编辑的主要工具。编辑基因时，在基因的上下游各设计一条向导RNA，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对与靶向目标序列结合，Cas9蛋白使该基因上下游的DNA双链断裂，对基因进行定点切割。生物体自身会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上引入一个供体DNA分子，这样细胞就会在断裂部位连入供体DNA片段，从而实现基因的替换或者突变。请回答下
2、列问题：(1)向导RNA和Cas9蛋白相当于基因工程的工具中的_。如果将向导RNA与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同导入猪的受精卵，可采用_方法。从上述材料可以看出生物细胞中还存在_酶。(2)如果培养用于器官移植的猪，可用基因编辑技术除去猪受精卵的_基因，或导入抑制该基因表达的_，培育出没有免疫排斥的移植器官。(3)将基因编辑的受精卵培育成用于器官移植的猪，首先要将受精卵培养在含有无机盐和有机盐类，而且还要有维生素、_、氨基酸、_及动物血清等物质的培养液中。当胚胎发育到_期或之前，将其移植到受体内完成胚胎发育。解析(1)根据题干分析可知：向导RNA和Cas9蛋白是基因编辑的主要工具，Cas9
3、蛋白使该基因上下游的DNA双链断裂，对基因进行定点切割，故向导RNA和Cas9蛋白相当于基因工程的工具中的限制酶；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，故如果将向导RNA与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同导入猪的受精卵，可采用显微注射方法。从题述材料可以看出，生物体自身会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现细胞中目标基因的敲除，故生物细胞中还存在DNA连接酶。(2)不同生物进行器官移植时存在免疫排斥反应，如果培养用于器官移植的猪，可用基因编辑技术除去猪受精卵的抗原决定基因，或导入抑制该基因表达的某种调节因子，抑制抗原基因的表达，培育出没有免疫排斥的移植器官。(3)将基因编辑的受精
4、卵培育成用于器官移植的猪，要经过早期胚胎培养，早期胚胎培养的培养基要含有有机盐、无机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸及动物血清等物质。处于囊胚(或桑椹胚)期的胚胎还没有与母体建立组织上的联系，故当胚胎发育到囊胚(或桑椹胚)期或之前，将其移植到受体内完成胚胎发育。答案(1)限制酶显微注射DNA连接(2)抗原决定某种调节因子(3)激素核苷酸囊胚(或桑椹胚)2(2019太原二模)请回答下列问题：(1)氨基酸序列分析技术和DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。DNA合成仪的问世为_、_、_的获得提供了方便。(2)研究人员用大肠杆菌作生产菌，利用基因工程技术分别生产胰岛素两条链。由A、B两
5、条肽链可推导出A、B基因的碱基序列，依据是_。因为A、B基因中的脱氧核苷酸数量较少，常用_获取目的基因。(3)检测A、B基因是否导入受体细胞时，常用_作探针。检测胰岛素基因是否表达常用_杂交方法。(4)引导肽是由引导肽基因控制合成的一段多肽序列，若在胰岛素的A、B肽链的前端加上引导肽序列后，可将A、B肽链引导到大肠杆菌的细胞膜外，便于A、B肽链提取。为实现上述目的，操作是_。在以后的体外加工过程中，需要用_切除引导肽。解析(1)DNA合成仪可以用于体外DNA分子小片段的合成，因此为小分子量的DNA的合成、PCR扩增中引物的合成以及基因工程中基因探针的制作提供了方便。(2)根据胰岛素两条链上的氨
6、基酸序列，利用氨基酸与密码子的对应关系可以推导出mRNA上的核苷酸序列，进而根据碱基互补配对的关系推导出合成胰岛素A、B两条肽链的A、B基因的碱基序列。因为A、B基因中的脱氧核苷酸数量较少，常用人工合成法合成目的基因。(3)检测A、B基因是否导入受体细胞时，常用放射性同位素标记的目的基因的单链作为探针，与从受体细胞内取出的核DNA分子的单链进行杂交，观察有无杂交带的出现。检测胰岛素基因是否表达出胰岛素时，常用抗原抗体杂交法判断。(4)根据题意，在胰岛素的A、B肽链的前端加上引导肽序列后，可将A、B肽链引导到大肠杆菌的细胞膜外，便于A、B肽链提取，为了达到这一目的可以将A、B基因连接在引导肽基因
7、后构建基因表达载体，导入大肠杆菌细胞内。A、B肽链在以后的体外加工过程中需要切除引导肽序列，因此根据酶的专一性，需要用肽酶切除引导肽。答案(1)引物探针小分子量DNA(2)氨基酸和密码子的对应关系和碱基互补配对原则人工合成法(3)放射性同位素标记的A、B基因的一条单链抗原抗体(4)将A、B基因连接在引导肽基因后肽酶3(2019潮州二模)牛雄性胚胎中存在特异性HY抗原，可在牛早期胚胎培养液中添加HY单克隆抗体，筛选胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。请回答下列问题：(1)为了大量制备HY抗体，可以将HY抗原基因导入大肠杆菌或酵母菌进行表达。与大肠杆菌相比，选择酵母菌获取HY的优势是_
8、。(2)如图的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制酶的识别序列与切割位点。经BamH酶切后得到的目的基因可以与载体(不含BamH识别序列)被_酶切后的产物连接，理由是_。(3)可选择_期的胚胎，切下少量_细胞进行性别鉴定。待检验的细胞通常需要扩大化培养，当培养液中细胞数量不再增加时，若要使细胞继续增殖，可采用的方法是进行_。(4)利用HY抗体检测性别的原理是_。还可用SRYPCR的方法鉴定性别，在PCR过程中若1个DNA分子扩增了4次，则消耗引物_个。解析(1)与大肠杆菌相比，选择酵母菌获取HY的优势是酵母菌是真核生物，具内质网、高尔基体等生物膜系统，能对HY抗原
9、基因合成的多肽进行高效加工。(2)观察图示可以看出，BamH和Sau3A两种限制酶切割基因片段产生的黏性末端相同，因此经BamH酶切后得到的目的基因可以与载体(不含BamH识别序列)被Sau3A酶切后的产物连接。(3)可选择囊胚期的胚胎，切下少量滋养层细胞进行性别鉴定。待检验的细胞通常需要扩大化培养，当培养液中细胞数量不再增加时，若要使细胞继续增殖，可采用的方法是进行传代培养。(4)可用抗原抗体杂交的方法通过HY抗体检测动物性别。在PCR过程中若1个DNA分子扩增了4次，则产生了16个DNA分子、32条单链，除去原来的两条母链，共需要引物32230个。答案(1)酵母菌是真核生物，具有生物膜系统
10、，能对HY抗原基因合成的多肽进行高效加工(2)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(3)囊胚滋养层传代培养(4)抗原抗体特异性结合304(2019龙岩模拟)草莓是营养价值较高的水果，因其易受病毒的感染而导致产量和品质均下降。生产上常采用一些新技术手段进行改良或培育抗病毒的新品种。回答下列问题：(1)对品质优良的草莓种植一段时间后进行脱毒处理。通常取草莓植株的_进行组织培养即可获得无病毒组培苗，原因是_。(2)利用体细胞诱变育种的方法培育抗病毒的草莓突变体幼苗，即对草莓的_进行化学或物理的诱变处理，促使其发生突变，再通过诱导分化形成突变植株。(3)利用转基因技术培育抗病毒草莓，即将
11、草莓病毒的外壳蛋白基因(SMYELVCP)导入草莓基因组中。首先利用PCR技术对目的基因SMYELVCP进行扩增。在PCR扩增仪中除加入目的基因及其引物外，还需加入_、_等物质。其中加入的引物可使DNA聚合酶能够从_开始连接脱氧核苷酸。从转基因草莓中提取的RNA，可用_与之进行分子杂交，以判断目的基因SMYELVCP是否在草莓细胞中成功转录。(4)20世纪60年代科学家尼伦伯格和马太等提出并证实了遗传密码的存在，使人们认识到自然界中从微生物到人类共用一套_，而且为基因的_等提供了理论依据。解析(1)由于植物分生区(如茎尖)附近病毒极少，甚至无病毒，故培育脱毒苗时，一般选取植物的分生区(如茎尖或
12、芽尖或根尖)作为外植体。(2)愈伤组织具有分裂、分化的能力，利用体细胞诱变育种的方法培育抗病毒的草莓突变体幼苗，实际上就是对草莓的愈伤组织进行化学或物理的诱变处理，促使其发生突变，再通过诱导分化形成突变植株。(3)在PCR扩增仪中除加入目的基因及其引物外，还需加入dNTP、Taq酶等物质，其中加入的引物可使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。从转基因草莓中提取的RNA，可用DNA分子杂交的方法，让含SMYELVCP的基因探针与之进行分子杂交，以判断目的基因SMYELVCP是否在草莓细胞中成功转录。(4)自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码，为基因的分离和合成等提供了理论依据。答案
13、(1)分生区(或茎尖或根尖或芽尖)植物分生区附近的病毒极少，甚至无病毒(2)愈伤组织(3)dNTP(或dATP、dTTP、dCTP、dGTP)Taq酶引物的3端含SMYELVCP的基因探针(4)遗传密码分离和合成5(2019深圳模拟)叶绿体基因工程是将外源基因导入叶绿体中的一项工程技术，烟草叶绿体基因工程在基础研究、遗传改良以及生物反应器研究等方面都发挥了极为重要的作用，表现出巨大的应用前景。请回答下列问题：(1)叶绿体基因工程常将含有外源基因的质粒包裹在金粉上，通过轰击进入叶绿体中从而实现目的基因的导入，这种目的基因导入的方法称为_。叶绿体基因组分为基因区和基因间隔区，叶绿体中基因间隔区序列
14、通常被作为插入位点，其目的是_。检测目的基因是否成功导入的方法是_。(2)烟草对壮观霉素(又名奇霉素，一种抗生素)具有较强的敏感性，构建基因表达载体时，质粒上的壮观霉素抗性基因可作为_，其作用是_；用于筛选和培养的培养基中应加入_。(3)与细胞核基因工程相比，叶绿体基因工程能防止细胞质内的蛋白酶对目标蛋白的消化作用。其原因是_，并且由于_，即不会造成基因污染。解析(1)把目的基因导入植物细胞可以采用基因枪法，叶绿体基因工程常将含有外源基因的质粒包裹在金粉上，通过轰击进入叶绿体中从而实现目的基因的导入，该方法称为基因枪法。叶绿体基因组分为基因区和基因间隔区，为了避免外源基因插入后对叶绿体内源基因
15、表达造成影响，常选择基因间隔区序列作为插入位点。可以用DNA分子杂交法检测目的基因是否成功导入。(2)烟草对壮观霉素(奇霉素)具有较强的敏感性，构建基因表达载体时，质粒上的壮观霉素抗性基因可作为标记基因，以便于目的基因的筛选和鉴定；可以在培养基中加入壮观霉素(或奇霉素)用于筛选和培养含目的基因的受体细胞。(3)与细胞核基因工程相比，叶绿体基因工程将目的基因导入叶绿体中，叶绿体具有双层膜，将表达的蛋白质束缚在叶绿体内，能防止细胞质内的蛋白酶对目标蛋白的消化作用，并且由于外源基因不会随花粉传播扩散，即不会造成基因污染。答案(1)基因枪法避免外源基因插入后对叶绿体内源基因表达造成影响DNA分子杂交技
16、术(2)标记基因便于目的基因的筛选和鉴定壮观霉素(或奇霉素)(3)叶绿体具有双层膜，将表达的蛋白质束缚在叶绿体内外源基因不会随花粉传播扩散6(2019泉州二模)细胞工程取得了伟大的成就，这些成就离不开科学家兢兢业业的研究。请回答：(1)1958年，斯图尔德用胡萝卜根形成层培养出了胡萝卜植株，1970年，斯图尔德用悬浮培养的单个细胞也得到了再生植株，这证明了_。胡萝卜组织培养过程中，脱分化阶段和再分化阶段所使用的培养基不同之处主要是_。(2)1907年，哈里森用淋巴液(一种天然培养基)成功培养了蝌蚪的神经元细胞，证明了_。动物细胞培养也可使用添加血清等天然成分的合成培养基。合成培养基是指将细胞所
17、需的营养物质按_严格配制而成的培养基。(3)1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术。制备单克隆抗体的过程中，将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中产生的B淋巴细胞融合后，用特定的选择培养基进行筛选，目的是筛选出_细胞。筛选出的细胞，还需要进行克隆化培养以进行检测筛选，目的是筛选出_。单克隆抗体常用作于体外诊断试剂，原因是_。解析(1)将单个细胞诱导得到了再生植株，这证明植物细胞具有全能性；在植物组织培养过程中，激素的比例不同可以影响植物的发展趋势，故在植物脱分化与再分化过程中，所使用的培养基有所不同。(2)用培养基可成功培养出蝌蚪的神经元细胞，证明了动物组织体外培养的可行性；合成培养基是指将细胞
18、所需的营养物质按种类和数量严格配制而成的培养基。(3)在单克隆抗体的制备过程中，需要经过两次筛选：用特定的选择培养基进行筛选，目的是筛选出杂交瘤细胞第一次筛选；筛选出的杂交瘤细胞还需要进行克隆化培养以进行检测筛选(第二次筛选)，目的是筛选出既能大量增殖，又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。因单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、可大量制备等优点，常被用作于体外诊断试剂。答案(1)植物细胞具有全能性脱分化和再分化所需的激素比例不同(2)动物组织体外培养的可行性(答案合理即可)种类和数量(3)杂交瘤能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞单克隆抗体纯度高、特异性强7(2019山东模拟)如图表示通过现代生物技术制备抗体
19、的两种途径。据图回答下列问题：(1)利用上述两种方法制备抗体1和抗体2过程中用到的生物技术手段主要有_(至少答出两点)。(2)从小鼠的_中先获取抗体基因的mRNA，再通过逆转录得到cDNA，cDNA中_(填“含有”或“不含有”)内含子。抗体基因还可通过PCR技术扩增获得。在PCR反应体系中，加入dNTP(dCTP、dATP、dGTP和dTTP)的作用是_。(3)方法二中，_(填“需要”或“不需要”)利用Ca2处理大肠杆菌制备感受态细胞，原因是_。(4)抗体1和抗体2的氨基酸排列顺序相同，两者的生理活性_(填“相同”或“不相同”)，原因是_。解析(1)据图分析可知，题述两种方法制备抗体1和抗体2
20、过程中用到的生物技术手段主要有动物细胞培养、动物细胞融合、转基因技术。(2)从小鼠的B细胞(浆细胞)中先获取抗体基因的mRNA，再通过逆转录得到cDNA，cDNA中不含有内含子。抗体基因还可通过PCR技术扩增获得。在PCR反应体系中，加入dNTP(dCTP、dATP、dGTP和dTTP)的作用是提供合成DNA的原料和能量。(3)方法二中，不需要利用Ca2处理大肠杆菌制备感受态细胞，原因是噬菌体可以侵染大肠杆菌，将重组DNA分子注入大肠杆菌。(4)抗体1和抗体2的氨基酸排列顺序相同，两者的生理活性不相同，原因是抗体2是由大肠杆菌产生的，其形成过程没有经过内质网和高尔基体加工，抗体1是由杂交瘤细胞
21、产生的，其形成过程经过内质网和高尔基体加工。答案(1)动物细胞培养、动物细胞融合、转基因技术(2)B细胞(或浆细胞)不含有提供合成DNA的原料和能量(3)不需要噬菌体可以侵染大肠杆菌，将重组DNA分子注入大肠杆菌(4)不相同抗体2是由大肠杆菌产生的，其形成过程没有经过内质网和高尔基体加工，抗体1是由杂交瘤细胞产生的，其形成过程经过内质网和高尔基体加工8(2019贵阳二模)2017年11月，Nature发表了科学家的研究成果，他们借助转基因干细胞，成功挽救一名患有由基因突变导致的罕见皮肤病的小男孩，使其拥有全新的皮肤。简要过程如右图所示，请回答下列问题：(1)目前获得多潜能干细胞的方法有很多，如
22、可采用细胞核移植技术，将体细胞的细胞核转移到_细胞中，再将这种重组细胞体外培养至囊胚阶段，从中分离_进行培养，该方法能获得多潜能干细胞的根本原因是_。(2)从基因文库中获取“正常基因”是常用方法之一，从基因文库中获取目的基因是比较复杂的，需要根据目的基因的有关信息，如_(答出两点即可)等特性获取目的基因。图中病毒在此过程中，作为_，将正常基因送入皮肤干细胞。(3)从小男孩尚存的正常皮肤上采集一小块皮肤(包括其中干细胞)，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，目的是_。对改造的皮肤干细胞进行细胞培养时，应定期更换培养液，目的是_。解析(1)获得多潜能干细胞的方法可采用细胞核移植技术，即将体细胞的细胞核
23、转移到去核的卵母细胞中形成重组细胞，再将重组细胞体外培养至囊胚阶段，从中分离出内细胞团进行培养。由于动物细胞核具有全套的遗传信息，所以利用该方法能获得多潜能干细胞。(2)从基因文库中获取目的基因需要根据目的基因的有关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性获取目的基因。图中病毒在此过程中，作为运载体，将正常基因送入皮肤干细胞。(3)动物细胞培养过程中，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理的目的是使取下的皮肤细胞分散成单个细胞。对改造的皮肤干细胞进行细胞培养时，应定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害
24、。答案(1)去核的卵母内细胞团动物细胞核具有全套的遗传信息(2)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质(答出两点即可)运载体(3)使取下的皮肤细胞分散成单个细胞清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害9(2019武汉模拟)克隆猴是我国科学家用体细胞克隆出的世界首例灵长类动物，其步骤如下：(1)进行体细胞核移植前，从具有优良性状的B猴体中取体细胞进行培养，培养条件除营养、温度和pH适宜外，还应保证_(答出三点)。核移植前还需对A猴卵母细胞进行去核操作，其目的是_。(2)经核移植得到重组细胞后，一般还需经过_和胚胎移植，才能得到
25、克隆猴。为使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致，需要对供、受体母猴用激素进行_处理。(3)体细胞的细胞核必须被移植到去核卵母细胞后才能表现出全能性，原因主要是_。根据这一启示，请提出一种恢复体细胞分裂分化能力的新思路：_。解析(1)进行体细胞核移植前，从具有优良性状的B猴体中取体细胞进行培养，培养条件除营养、温度和pH适宜外，还应保证无菌、无毒、适宜的气体环境。核移植前还需对A猴卵母细胞进行去核操作，其目的是保证核移植的胚胎或动物的遗传物质主要来自核供体。(2)经核移植得到重组细胞后，一般还需经过早期胚胎培养和胚胎移植，才能得到克隆猴。为使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致，需要对供、受体
26、母猴用激素进行同期发情处理。(3)体细胞的细胞核必须被移植到去核卵母细胞后才能表现出全能性，原因主要是卵母细胞的细胞质中含有促进细胞核全能性表达的物质；根据这一启示，恢复体细胞分裂分化能力的新思路为从卵母细胞中分离出能促进细胞核全能性表达的物质，将其导入体细胞中。答案(1)无菌、无毒、适宜的气体环境保证核移植的胚胎或动物的遗传物质主要来自核供体(2)早期胚胎培养同期发情(3)卵母细胞的细胞质中含有促进细胞核全能性表达的物质从卵母细胞中分离出能促进细胞核全能性表达的物质，将其导入体细胞中10(2019石家庄一模)经过世界各国科学家的漫长探索，植物细胞工程技术已进入高速发展阶段，动物细胞工程技术已
27、成为生物科学领域一颗十分耀眼的明珠。请回答下列相关问题：(1)植物组织培养过程中，由于培养细胞处于_状态，因此容易受到培养条件和外界影响而发生突变。若对愈伤组织进行物理或化学诱变处理，促使其发生突变，再通过_形成植株，从中筛选出抗病、高产优质的突变体，就可以培育成新品种。(2)用植物体细胞杂交技术培育番茄马铃薯，就是将这两种植物体细胞，在一定条件下_。这项研究虽然没有地上长番茄，地下结马铃薯，但是在_上取得了重大突破。(3)一种由正常体细胞经人工逆转后形成的多能干细胞iPSC经基因修饰后分化成特定的T淋巴细胞。体外培养iPSC过程中，通常需要在培养基中添加_等天然成分。(4)制备抗人绒毛膜促性
28、腺激素的单克隆抗体过程中，需要用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该细胞的特点是_，对杂交瘤细胞还需进行_培养，并用_对其进行专一抗体检测，经多次筛选获得足够数量的所需细胞进行体内或体外培养。解析(1)植物组织培养过程中，由于培养细胞处于分生状态，因此容易受到培养条件和外界影响而发生突变。若对愈伤组织进行物理或化学诱变处理，促使其发生突变，再通过诱导分化形成植株，从中筛选出抗病、高产优质的突变体，就可以培育成新品种。(2)植物体细胞杂交技术能在一定条件下将两种植物细胞融合形成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体。在克服不同生物远缘杂交的障碍上取得了重大突破。(3)动物细胞培养过程中，通常需要在培养基中添加血清(浆)等天然成分。(4)杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量繁殖，又能产生专一性(特异性)抗体，在制备抗人绒毛膜促性腺激素的单克隆抗体过程中，对杂交瘤细胞还需进行克隆化培养，并用人绒毛膜促性腺激素对其进行专一抗体检测，经多次筛选获得足够数量的所需细胞进行体内或体外培养。答案(1)分生(或不断分裂或脱分化)诱导分化(或再分化)(2)融合形成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体克服不同生物远缘杂交的障碍(或克服生殖隔离)(3)血清(浆)(4)既能迅速大量繁殖，又能产生专一(特异性)抗体克隆化人绒毛膜促性腺激素
