1、课题 2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段课前预习导学目标导航 学习目标重点难点 1.通过与细胞内的 DNA 复制对比说明 PCR 的原理。2.用流程图表示 PCR 的操作步骤。3.尝试 PCR 的基本操作。4.讨论 PCR 的应用。重点:1.说明 PCR 的原理。2.尝试 PCR 的基本操作。难点:理解 PCR 的原理。预习导引一、PCR 原理1.概念:是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术,它能以极少量的DNA 为模板,在几小时内复制出上百万份的 DNA 拷贝。2.DNA 复制需要的条件:解旋酶、DNA 母链、4 种脱氧核苷酸、DNA 聚合酶和引物。预习交流 1DNA 复制为什么还需要引物
2、?提示:DNA 聚合酶不能从头合成 DNA,只能从 3端延伸 DNA 链。因此,DNA 复制需要引物,DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸。3.DNA 的热变性:在 80100 的温度范围内,DNA 的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性;当温度缓慢降低后,两条彼此分离的 DNA 链又会重新结合成双链,这个过程称为复性。4.PCR 反应的条件一定的缓冲溶液;DNA 模板;分别与两条模板链相结合的两种引物;四种脱氧核苷酸;耐热的 DNA 聚合酶,一般用 Taq DNA 聚合酶;控制温度。二、PCR 反应过程1.变性:当温度上升到 90 以上时,双链 DNA 解旋为单链,一般实
3、验温度为 95。2.复性:温度下降到 50 左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合,一般实验温度为 55。3.延伸:温度上升到 72 左右,溶液中的四种脱氧核苷酸在 TaqDNA 聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。预习交流 2细胞内的 DNA 是怎样复制的?(1)回忆并简述 DNA 的复制过程。提示:DNA 分子首先在解旋酶的作用下解旋,然后以解开的每一段母链为模板,在 DNA 聚合酶等酶的作用下合成与母链碱基互补的一段子链,随着模板链解旋过程的进行,新合成的子链也不断延伸,同时,每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。(2)PCR 的变性过程实质上也
4、是解旋,PCR 的解旋和细胞内的 DNA解旋有何不同?提示:PCR 在高温条件下(90100)解旋,而细胞内的 DNA 在解旋酶的作用下解旋。三、实验操作1.PCR 仪:能够自动调控温度的仪器,实现 DNA 的扩增。如果没有PCR 仪,可用 3 个恒温水浴锅代替,操作时在 3 个水浴锅中来回转移 PCR反应的微量离心管。2.微量离心管:一种薄壁塑料管,总容积为 0.5 mL。3.微量移液器:用于添加转移 PCR 配方中的液体。四、操作提示1.为避免外源 DNA 等因素的污染,实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。2.PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 储存。3.微量移液器
5、的枪头在吸取试剂后必须更换。预习交流 3DNA 在吸附性方面有何特点?DNA 很容易吸附在玻璃的表面,而不容易吸附在塑料的表面,由此推测 PCR 用到的微量离心管是用何种材质加工制作的?提示:是用塑料加工制作的。课堂合作探究问题导学一、PCR 的原理活动与探究 11.细胞内 DNA 复制需要的基本条件有哪些?该条件在 DNA 复制中起何作用?提示:细胞内 DNA 复制需要的基本条件和作用分别是:(1)解旋酶:打开 DNA 双链。(2)DNA 母链:提供 DNA 复制的模板。(3)4 种脱氧核苷酸:合成子链的原料。(4)DNA 聚合酶:催化合成 DNA 子链。(5)引物:使 DNA 聚合酶能够从
6、引物的 3端开始连接脱氧核苷酸。2.什么是引物?它有什么特点?用于 PCR 的引物一般长度是多少?提示:引物是一小段 DNA 或 RNA,它能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对。用于 PCR 的引物长度通常为 2030 个核苷酸。3.讨论:DNA 合成的方向有什么特点?两条子链的合成起始于 DNA的同一端吗?提示:(1)DNA 的羟基末端称为 3端,磷酸基团的末端称为 5端,且DNA 的一条链为 35,另一条互补链为 53,即 DNA 的两条链是反向的。(2)DNA 合成的方向总是从子链的 5端向 3端延伸(即沿母链的35),所以两条子链的合成分别起始于 DNA 的两端。4.PCR 技术中
7、,高温能使 DNA 双链解旋,但也会导致 DNA 聚合酶失活,如何解决?提示:寻找和使用耐高温的 DNA 聚合酶。迁移与应用 1PCR 过程中起催化作用的酶是()。A.解旋酶 B.RNA 聚合酶C.Taq DNA 聚合酶D.DNA 连接酶解析:PCR 技术解旋过程是利用了 95 高温使 DNA 变性解旋;RNA 聚合酶是转录过程所需的酶;DNA 连接酶是基因工程和 DNA体内复制所需的酶;PCR 技术延伸中所用的酶是 Taq DNA 聚合酶。答案:C细胞内 DNA 复制与 PCR 技术的比较 细胞内 DNA 复制PCR不同点解旋解旋酶催化,部分解旋解链95 高温解旋解链,双链完全分开酶解旋酶、
8、DNA 聚合酶、DNA 连接酶Taq DNA 聚合酶能量ATP不加温度体内温和条件95 55 72 特点整个 DNA 复制,只在分裂间期复制一次目的基因片段,按需要无限扩增相同点需 DNA 模板;需脱氧核苷酸作原料;子链延伸方向都是从 5端到 3端;都遵循碱基互补配对原则,半保留复制注:解旋酶的作用是使 DNA 两条链的氢键断开,而 DNA 聚合酶都是催化形成磷酸二酯键的。二、PCR 的反应过程活动与探究 21.PCR 一般要经历 30 多次循环,每次循环可以分为哪几步?提示:每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。2.PCR 循环之前,常要进行一次预变性,预变性的目的是什么?提示:预变性的目的
9、是增加大分子模板 DNA 彻底变性的概率。3.PCR 循环过程中,变性温度设置 94,时间设置 30 s 的原因是什么?提示:变性温度过低,解链不完全导致 DNA不能扩增,变性温度过高影响酶的活性;在此温度条件下如果处理时间过长,将会导致酶的钝化。4.PCR 缓冲液相当于细胞内的什么成分?提示:由于缓冲液为 DNA 的复制提供场所,相当于细胞内 DNA 复制的场所,所以缓冲液相当于核基质。5.当 PCR 反应体系的温度由变性后缓慢冷却到 50 左右时,引物与模板可结合,而解开的两个 DNA 模板链能够重新结合吗?为什么?提示:不能。(1)模板 DNA 链比引物长得多而且复杂得多,不易重新结合。
10、(2)引物和模板之间的碰撞机会远远高于两个 DNA 模板链之间的碰撞机会。(3)加入的引物的量较大,而模板数量少。6.PCR 过程中的 DNA 聚合酶能对最初的 DNA 模板进行完整的复制吗?为什么?提示:不能。第一次循环时,只能从引物结合的部位开始。由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合,进行 DNA 的延伸,由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合进行 DNA 的延伸之后,DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的 DNA 序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。7.决定 PCR 反应特异性的原因有哪些?提示:(1)待扩增 DNA 片段的特异性。(2)引物与模板特异性地结合。(3)
11、碱基互补配对原则。(4)耐高温的 Taq DNA 聚合酶的催化作用具有专一性。迁移与应用 2利用 PCR 技术扩增某 DNA 片段得到下图所示产物,则该产物至少经过几次循环才能产生?()A.1 次B.2 次C.3 次D.4 次解析:PCR 技术中,第一次循环产生两个 DNA 分子,每个 DNA 分子只有一条链具有引物。第二次循环产生四个 DNA 分子,其中两个 DNA分子只有一条链具有引物,另两个 DNA 分子两条链都具有引物。答案:B1.PCR 反应过程图解(1)变性:当温度上升到 90 以上时,双链 DNA 解旋为单链,如下图:(2)复性:系统温度下降至 55 时,两种引物通过碱基互补配对
12、与两条单链 DNA 结合,如下图:(3)延伸:当系统温度上升至 72 左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在 DNA 聚合酶的作用下,据碱基互补配对原则合成新的DNA 链,如下图:2.PCR 过程的温度条件和时间控制 变性复性延伸预变性94,5 min30 次94,30 s55,30 s72,1 min最后一次94,1 min55,30 s72,1 min三、PCR 实验操作和结果分析评价活动与探究 31.讨论 PCR 实验过程中有哪些注意事项。提示:(1)避免外源 DNA 污染:所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌。(2)缓冲液和酶分装成小份,-20 低温保存。(3)
13、每添加一种反应成分,更换一个移液器的枪头。(4)混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。2.如何判断 DNA 扩增成功?提示:(1)教材中的方法,可以通过计算 DNA 含量来评价扩增的效果。(2)电泳检测的方法,可以通过在紫外线下直接观察 DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。迁移与应用 3PCR 实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是()。A.反复洗涤 B.用酒精擦洗C.高压灭菌D.在-20 下储存解析:为了避免外源 DNA 等因素的污染,PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,
14、并在-20 下储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。答案:C1.PCR 体外扩增 DNA 片段的实验流程准备 (按照 PCR 反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上)移液 (用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分)混合 (盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁)离心 (将微量离心管放在离心机上,离心约 10 s。目的是使反应液集中在离心管底部)反应 (将离心管放入 PCR 仪中,设置程序进行反应:变性复性延伸)2.实验中 DNA 含量的测定DNA 在 260 nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA 的含量有关。可以利用 DNA 这一特点进行 DNA
15、含量的测定,具体方法如下:(1)稀释:2 L PCR 反应液,加入 98 L 蒸馏水,即将样品进行 50 倍稀释(2)对照调零:以蒸馏水作为空白对照,在波长 260 nm 处,将紫外分光光度计的读数调节至零(3)测定:取 DNA 稀释液 100 L 至比色杯中,测定 260 nm 处的光吸收值(4)计算:DNA 含量(g/mL)=50(260 nm 的读数)稀释倍数3.几种 PCR 方法有反转录 PCR、扩增未知序列的 PCR、致突变 PCR、定量 PCR、免疫 PCR 等方法,PCR 还可与其他方法联合使用,有很多新的联合法。(1)反转录 PCR反转录 PCR 就是把 RNA 提取后反转录成
16、互补 DNA,并以此互补DNA 链为模板进行的 PCR 反应。通常用于检测某种 RNA 是否被表达,或者比较其相对表达水平。(2)实时荧光定量 PCR所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物的荧光信号的实时检测,从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR的进行,PCR 产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。(3)免疫 PCR免疫 PCR 是利用抗原抗体反应的特异性和 PCR 扩增反应的极高
17、灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。当堂检测1.下列有关 PCR 的描述,不正确的是()。A.是一种酶促反应B.引物决定扩增的特异性C.扩增的对象是氨基酸序列D.扩增的对象是 DNA 序列解析:PCR 是特异扩增两个引物间的脱氧核苷酸序列,而不是氨基酸序列。答案:C2.引物长度通常为 2030 个核苷酸的一段()。A.DNAB.RNAC.DNA 或 RNAD.双链 DNA解析:DNA 复制过程均需要引物的参与,引物是一小段 RNA 或 DNA。答案:C3.PCR 利用了 DNA 的什么原理,来控制 DNA 的解聚与结合?()A.特异性B.稳定性C.热变性D.多样性解析:PCR 利用了 DNA
18、的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。答案:C4.PCR 过程中的复性是指()。A.在 90 以上时,两条 DNA 单链通过碱基互补配对形成 DNA 双螺旋B.在 50 左右,两条 DNA 单链通过碱基互补配对形成 DNA 双螺旋C.在 90 以上时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合D.在 50 左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合解析:PCR 过程中的复性发生在 50 左右的低温条件下,指引物与单链DNA 的结合,不是两条单链 DNA 的结合。答案:D5.标准的 PCR 过程一般分为变性、复性、延伸三大步,这三大步需要的温度依次是()。A.94、55、72 B.72、50、94 C.50、94、72 D.80、50、72 解析:当温度上升到 90 以上时,作为模板的双链 DNA 解旋成为单链DNA,称之为变性;当温度下降到 50 左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA结合,称为复性;当温度回升到72 时左右时(TaqDNA 聚合酶的最适反应温度),在单链上 4 种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则连接在引物之后,使引物链延伸,形成互补的 DNA双链,称为延伸。答案:A
