1、一、工具酶的发现和基因工程的诞生1基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA重组和转基因 技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在 DNA分子 水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术或转基因技术。2限制性核酸内切酶(简称限制酶)基因的剪刀 限制性核酸内切酶的来源：主要是从 原核生物 中分离纯化来的。限制性核酸内切酶的作用及作用特点：(1)能识别和切割DNA分子内一小段特殊的 核苷酸 序列(具有专一性)。(2)从特定部位(特定核苷酸序列)的两个核苷酸之间(磷酸二酯 键)切开。3DNA连接酶基因的针线 DNA连接
2、酶的作用是：把具有末端碱基互补配对的2个DNA片段连接在一起，催化形成 磷酸二酯 键，形成 重组DNA 分子。可以将外源目的基因和载体DNA连接在一起。4质粒最常用的运载体质粒作为运载体必须具备三个条件：(1)在 宿主 细胞中能保存下来并能大量复制。(2)有一个至多个 限制性核酸内切酶 切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322质粒就有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，可适于多种限制性核酸内切酶切割的DNA插入。(3)有一定的 标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带的氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。二、基因工程的原理和技术1基因
3、工程的基本原理让人们感兴趣的基因(即 目的基因)在宿主细胞中稳定和高效表达。2基因工程的基本操作步骤(1)获得目的基因有两种方法：目的基因的序列是已知的：用 化学 方法人工合成目的基因。目的基因的序列是未知的：从 基因文库 中提取目的基因。获得目的基因后，再用PCR技术扩增目的基因。(2)形成重组DNA分子用一定的 限制酶 切割质粒，使其出现一个切口，露出 粘性末端。用 相同的限制性核酸内切酶 切割目的基因，使其产生 相同的粘性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量 DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。(3)将重组DNA分子导入受体细胞基因工程中常用的受体细胞有：
4、大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞。(4)筛选含有目的基因的受体细胞根据 重组质粒上的抗生素抗性基因的抗性或荧光物质 筛选出含有目的基因的受体细胞。(5)目的基因的表达目的基因在宿主细胞中表达，产生人们需要的物质。1.下列粘性末端属于同一种限制酶切割而成的是()BABCD2.基因工程是在DNA分子水平上进行设计的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是()A人工合成基因B目的基因与运载体结合C将目的基因导入受体细胞D目的基因的检测和表达C考点1 工具酶的发现和基因工程的诞生1注意对基因工程概念应从以下几个方面理解操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本
5、过程剪切拼接导入筛选表达实质基因重组结果人类需要的基因产物2.基因工程诞生的理论基础(1)DNA是生物遗传物质的发现。(2)DNA双螺旋结构的确立。(3)遗传信息传递方式的认定。3限制性核酸内切酶的作用原理(如下图所示)一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制性核酸内切酶有数千种。DNA被限制性核酸内切酶切断后有两个反向互补的“粘性末端”。若用同一种限制性核酸内切酶切割几个DNA分子，会产生相同的粘性末端，能够通过碱基互补进行配对。限制酶的切割方式有两种：错切：形成粘性末端。如下图所示：平切：形成平末端。如下图所示：4.基因工程的运
6、载体除质粒外，基因工程常用的运载体还有：噬菌体，动植物病毒。基因工程运载体的作用是将目的基因送入受体细胞。【例1】降钙素是一种多肽类激素，临床上用于治疗骨质疏松症等。人的降钙素活性很低，半衰期较短。某科学机构为了研发一种活性高、半衰期长的新型降钙素，从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA，过程如下图。在此过程中发现，合成较长的核苷酸单链易产生缺失碱基的现象。分析回答下列问题：(1)Klenow酶是一种_酶，合成的双链DNA有_个碱基对。(2)获得的双链D
7、NA经EcoR(识别序列和切割位点GAATTC)和 BamH(识 别 序 列 和 切 割 位 点 GGATCC)双酶切后插入大肠杆菌质粒中，筛选含重组质粒的大肠杆菌并进行DNA测序验证。大肠杆菌是理想的受体细胞，这是因为它 _。设计EcoR和BamH双酶切的目的是_。要进行重组质粒的鉴定和选择，需要大肠杆菌质粒中含有_。(3)经DNA测序表明，最初获得的多个重组质粒，均未发现完全正确的基因序列，最可能的原因是_【解析】Klenow酶不是限制性核酸内切酶，也不是DNA连接酶，它是以DNA单链为模板，使子链延长，是一种DNA聚合酶，延长部分的碱基对是72218126或(7218/2)2126。用不
8、同酶切可以产生不同的粘性末端，有利于定向连接，由题干可知合成较长的核苷酸单链易产生缺失碱基的现象。【答案】(1)DNA聚合 126(2)繁殖快、为单细胞生物、遗传物质相对较少 保证目的基因和载体定向连接(或防止目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接)标记基因(3)合成的核苷酸单链仍较长，产生缺失碱基的现象考点2基因工程的原理和技术1获得目的基因 2形成重组DNA分子将目的基因和质粒结合形成重组质粒的过程是：(1)用一定的限制性核酸内切酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口；(2)用同种限制性核酸内切酶切割目的基因，产生相同的粘性末端；(3)将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适
9、量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。可用如下图解表示：目的基因与运载体结合的结果可能有三种情况：目的基因与目的基因结合，质粒与质粒结合，目的基因与质粒结合。3将重组DNA分子导入受体细胞(1)基因工程中常用的受体细胞有：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞。其中植物细胞可以是受精卵或体细胞(可经组织培养发育成完整植株)，动物细胞是受精卵(因为动物体细胞的全能性受到限制)。(2)将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和运载体的类型不同，所采用的导入方法也不同。导入方法比较如下：植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农 杆 菌 转 化 法(主要)，基因枪法和花粉管通道法显微
10、注射技术，病毒感染法Ca2处理细胞法受体细胞受精卵或体细胞 受精卵微生物细胞转化过程构建重组质粒农杆菌导入植物细胞整合到植 物 细 胞 的DNA上表达构建重组质粒显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组质粒与感受态细胞混合重组质粒进入感受态细胞4.筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞的主要方法有：(1)筛选的依据是重组质粒上的标记基因。即根据重组质粒上的抗性基因，在培养基中加入相应的抗生素，具有抗性的受体细胞能正常生长，说明已成功导入了目的基因。未导入重组质粒的细胞因无抗性而不能正常生长(死亡)。也可以根据重组质粒上的荧光基因所表达的荧光物质来确定重组
11、质粒是否成功导入受体细胞。(2)用DNA探针技术(核酸分子杂交法)进行鉴定。所用的探针必须用目的基因制成，具有放射性标记或荧光标记。(3)用DNA序列分析鉴定。(4)用PCR扩增方法进行鉴定。5目的基因的表达基因成功表达的标志是受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质。【例2】下图是将人类的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用的运载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题：(1)人工合成目的基因的途径一般有哪两条？(2)如何将目的基因和质粒结合成重组质粒？(3)目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不
12、高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有极少数导入的是重组质粒。可通过以下步骤鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒：将得到的细菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就是导入了质粒A或重组质粒的细菌，反之则没导入。使用这种方法鉴别的原因是什么？(4)若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，会发生的现象是什么？(5)导入细菌B细胞的目的基因成功表达的标志是什么？(2)用一定的限制性核酸内切酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口；用同种限制性核酸内切酶切割目的基因，产生相同的粘性末端；将切下的目的基因片段
13、插入质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。(3)普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因。(4)有的能生长，有的不能生长。导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有抗四环素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在抗四环素基因中，抗四环素基因的结构被破坏。(5)受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。注意比较与DNA有关的酶1DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基。2DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解旋成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：除用解旋酶使DNA解旋成
14、两条长链以外，在适当的高温(如94)、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。3DNA聚合酶：能将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。4DNA连接酶：能通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。5注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。1.(2011浙江卷)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是()A每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子【解析】每个限制性核酸内切酶识别位点只能插入一个外源基因
15、，选项C错误。重组质粒导入受体细胞时，一个细胞可以接受多个质粒，选项A正确。作为一个合格的表达载体，重组质粒可以有一个或多个限制性核酸内切酶识别位点，选项B正确。外源基因可以多次表达，合成多个产物，选项D正确。【答案】C2.(2009浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达【解析】载体上的抗性基因主要起着标记基因的作用，有利于筛选含重组DNA的细胞，并不能促进目的基因的表达。
16、【答案】D3.(2008全国卷)已知某种限制性核酸内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是()A3 B4 C9 D12【解析】本题考查的是基因工程方面的内容，每一种限制性核酸内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的限制性核酸内切酶切后的片段不一样，如果将图中的三个切割位
17、点自左至右依次标为甲、乙、丙，由甲处切，可产生两个片段，即a和右边的bcd段，如果只从乙处切，就有ab和cd段，如果只从丙处切，就有abc和d段，甲、乙同时切，就有a、b和cd段，乙、丙同时切，就有ab和c、d段，甲、丙同时切，就有a、bc、d三种片段，甲、乙、丙三者都同时切，就有a、b、c、d四种片段。所以本题选C。【答案】C4.(2011温州二模卷)下表为常用的限制性核酸内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，正确的是()限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHGGATCCKpnGGTACCEcoRGAATTCSau3AGATCHindGTYRA
18、CSmaCCCGGG(注：YC或T，RA或G)A限制酶切割后不一定形成粘性末端 B限制酶的切割位点在识别序列的内部 C不同限制酶切割后一定形成不同的粘性末端 D种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列 【解析】从表格中的各种限制酶识别序列和切割位点分析，限制酶切割后不一定形成粘性末端，如限制酶Sma，它的识别序列和切割位点是CCCGGG，切割DNA分子后不会形成粘性末端。限制酶的切割位点不一定在识别序列的内部，如限制酶Sau3A的识别序列和切割位点是GATC。不同限制酶切割后可能形成相同的粘性末端，如限制酶BamH和Sau3A，虽然识别序列和切割位点不同，但它们切割后形成的粘性末端相同。一般来说，一
19、种限制酶只能识别一种核苷酸序列，但也有例外，如限制酶Hind，它的识别序列和切割位点是GTYRAC，这里的YC或T，RA或G，因此它的识别序列和切割位点可能有4种。【答案】A5.(2010郑州质检)限制酶可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamH、EcoR、Hind及BgI的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位。其中哪两种限制酶切割出来的DNA片段末端可以互补粘合，其末端互补序列是()ABamH和EcoR；末端互补序列：AATT BBamH和Hind；末端互补序列：GATC CBamH和BgI；末端互补序列：GATC DEcoR和Hind；末端互补序列：AATT
20、【解析】一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点切割DNA分子，结合碱基互补配对原则可确定选项C正确。【答案】C6.(2010厦门质检)下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是()A一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 B限制性核酸内切酶的活性受温度影响 C限制性核酸内切酶能识别和切割RNA D限制性核酸内切酶可从原核生物中提取【解析】限制酶是在原核生物中发现的，用于切割DNA，是原核生物的一种自我保护机制；真核生物没有限制酶。【答案】C7.(改编题)质粒是基因工程中常用的运载体，下列有关质粒的说法正确的是()A细菌的基因只存在于质粒上 B质粒是基因工程中的重要工具酶 C质粒不仅存在于细菌中，也存在于病毒中 D质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核外的细胞溶胶中 【解析】质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子，存在于细菌拟核外的细胞溶胶中，它不存在于病毒中。细菌的基因主要存在于拟核的DNA上，也存在于质粒上。质粒是基因工程中常用的运载体，它并不是酶。【答案】D
