1、热点微练28 PCR技术的应用(时间：15分钟)1.(2021江西南昌四校联考)2019年6月17日，新华社报道了屠呦呦及其团队经过多年攻坚，在“抗疟机理研究”“抗药性成因”“调整治疗手段”等方面取得新突破。之后屠呦呦团队提出应对“青蒿素抗药性”难题的切实可行的治疗方案。某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，让青蒿素合成过程的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图：重组质粒青蒿回答下列问题：(1)图中酶1是_，酶2是_。利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至9095 ，目的是破坏DNA分子中的_键。在构建重组Ti质粒的过程中，需将目的基因插入
2、Ti质粒的_。(2)检验目的基因是否整合到青蒿基因组，可以将放射性同位素标记的_制成基因探针，与青蒿基因组DNA杂交。理论上，与野生青蒿相比，该探针与转基因青蒿DNA形成的杂交带的量_(填“较多”或“较少”)。(3)据图分析，农杆菌的作用是_。为准确判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的_。答案(1)逆转录酶限制酶氢TDNA(2)fps基因较多(3)感染植物，将目的基因转移到受体细胞中青蒿素产量解析(1)据图示可知，酶1促进逆转录的过程，故为逆转录酶，酶2用于切割目的基因和质粒，故为限制性核酸内切酶(限制酶)。利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链
3、的条件是加热至9095 ，目的是破坏DNA分子中的氢键。构建重组Ti质粒的过程中，需将目的基因插入Ti质粒的TDNA。(2)检验目的基因是否整合到青蒿基因组，可用DNA分子杂交法，即将fps基因制成基因探针，与青蒿基因组DNA杂交。与野生青蒿相比，该探针与转基因青蒿DNA形成的杂交带的量较多。(3)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，由图可知，农杆菌的作用是感染植物，将目的基因转移到受体细胞中。为准确判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量，若产量增高，则说明达到了目的。2.(2021四川大数据统一监测)如图是利用转基因技术生产干扰素的简化流程。回答下列
4、问题：(1)进行过程的前提是要根据干扰素基因的_设计引物。(2)过程需加热至9095 ，然后冷却至5560 ，如此操作的目的是_。据图可知，欲获得干扰素基因，至少需要复制_次。(3)图中A的名称是_，A上与RNA聚合酶识别和结合的部位称为_。(4)为检测干扰素基因在酵母菌细胞中是否转录，可用_作探针，与从细胞中提取的_进行分子杂交。答案(1)一段核苷酸序列(2)使DNA解链，然后使引物结合到互补DNA链上3(3)重组质粒启动子(4)放射性同位素、生物素或荧光染料等标记的干扰素(目的)基因mRNA解析(1)进行PCR的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成一对引物，因此进行过程的前
5、提是要根据干扰素基因的一段核苷酸序列设计引物。(2)PCR过程中需加热至9095 ，目的是使DNA双链解旋，然后冷却至5560 ，目的是使引物结合到互补DNA链上。根据PCR复制的特点，结合图示可知，图示中干扰素基因的两条链均应是第二次复制才能形成的子链，所以至少需要复制三次才能形成图中的干扰素基因。(3)图中A是干扰素基因和质粒连接形成的重组质料(或基因表达载体)，A上与RNA聚合酶识别和结合的部位称为启动子。(4)基因转录的产物包括mRNA，由于转录过程中遵循碱基互补配对原则，因此为检测干扰素基因在酵母菌细胞中是否转录，可用放射性同位素、生物素或荧光染料等标记的干扰素(目的)基因作探针，与
6、从细胞中提取的mRNA进行分子杂交。3.(2021广东省六校联考)现有甲、乙两种双子叶植物，植物甲因含有抗旱基因而具有极强的抗旱性，植物乙抗旱性低。若将该抗旱基因转移至植物乙中，有可能提高后者的抗旱性。目前，基因工程中使用的限制酶主要是从原核生物中分离纯化获得的。含有限制酶的细胞通常还具有相应的甲基化酶，它可对自身DNA序列进行甲基化修饰。回答下列问题：(1)为获取抗旱基因，可以先从植物甲中提取该基因的mRNA，然后经_过程获得cDNA。基因工程的核心步骤是_。(2)使用PCR技术扩增抗旱基因时，可选择图中A、B、C、D四种单链DNA片段中的_作为引物，此过程还需要_酶，但不需要解旋酶，而是利
7、用_使DNA解旋。(3)原核细胞中的限制酶可切割外源DNA，但不破坏自身DNA，其原因可能是_；_。(4)在大田里栽培转基因植物时，要求转基因植物与传统作物之间间隔足够远的距离，以免_。答案(1)逆转录构建基因表达载体(2)B、CTaq高温(3)细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列甲基化酶对细胞自身的DNA进行甲基化修饰，限制酶无法识别修饰后的DNA序列(4)目的基因随花粉传播到传统植物中，造成基因污染解析(1)从植物甲细胞中提取目的基因的mRNA，需通过逆转录获得cDNA。基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。(2)DNA合成的方向为53，因此使用PCR技术扩增抗旱基因时，应选用图中的
8、B、C作为引物，该过程需要Taq酶，不需要解旋酶，而是利用高温使DNA解旋。(3)原核细胞中的限制酶可切割外源DNA，但不破坏自身的DNA，可能的原因是细胞自身DNA分子中没有该限制酶的识别序列；甲基化酶对细胞自身的DNA进行甲基化修饰，限制酶无法识别修饰后的DNA序列。(4)在大田里栽培转基因植物时，要求转基因植物和传统作物之间间隔足够远的距离，以免目的基因随花粉传播到传统植物中，造成基因污染。4.(2021广东珠海质量监测)变异链球菌在牙面的黏附、集聚是龋齿发生的先决条件。转基因防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因(PAcA基因)转入植物的表达载体中，利用
9、植物生物反应器生产的基因工程疫苗。请回答下列相关问题：(1)转基因植物的制备单一使用PAcA基因，机体的免疫应答不理想，霍乱毒素中有增强机体免疫应答的氨基酸序列(CTB)，将CTB基因与PAcA基因连接成嵌合(PAcACTB)基因，作为_与Ti质粒的TDNA拼接，构建表达载体。用_法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株。(2)转基因植株目的基因的PCR鉴定与检测已知PAcACTB基因部分序列如下(左侧为基因的首端)：5CCGTGTATGCCT33GGCACATACGGA5根据上述序列选择引物_(填字母)对目的基因进行PCR扩增。A.引物：5GGCACA3B.引物：5AGGCA
10、T3C.引物：5CCGUGU3D.引物：5CCGTGT3反应结束后，通过电泳检测PCR产物，结果如右图(1号来自未转化植株，2号是含PAcACTB基因的质粒，38号来自转基因植物)，从结果可以看出，_号植物含有PAcACTB基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，其可能的原因是_。答案(1)目的基因农杆菌转化(2)B、D3、5、8目的基因(PAcACTB基因)没有转录或转录的mRNA没有翻译解析(1)将CTB基因与PAcA基因连接成嵌合(PAcACTB)基因，作为目的基因与Ti质粒的TDNA拼接，构建表达载体。将基因表达载体导入离体的黄瓜叶肉细胞中可以用农杆菌转化法。(2)PCR技术中，子链合成的方向是从5到3，因此应该选择引物B、D。1号来自未转化植株，2号是含PAcACTB基因的质粒，38号来自转基因植物，从结果可以看出，3、5、8号植物含有PAcACTB基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，可能的原因是目的基因(PAcACTB基因)没有转录或转录的mRNA没有翻译。
