1、 基础对点知识点一蛋白质分离的原理和方法1.分离不同种类的蛋白质依据的原理不包括()A分子的形状和大小B所带电荷的性质和多少、吸附性质C对其他分子的亲和力D蛋白质分子的组成元素答案D解析分离不同种类的蛋白质依据的原理包括分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、吸附性质、对其他分子的亲和力和蛋白质分子的溶解度等。蛋白质分子的组成元素不是分离不同蛋白质的依据。2利用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是()A蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小B蛋白质相对分子质量的大小C蛋白质所带电荷的多少D蛋白质溶解度的大小答案B解析凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内
2、部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。3下列有关电泳的叙述，不正确的是()A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度C进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动D常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳答案C解析电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A正确，C错误；由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不
3、同，会使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，B正确；琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常见的电泳方法，D正确。4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是()A增大蛋白质的相对分子质量B使蛋白质完全变性失活C掩盖不同种蛋白质间的电荷差别D减少蛋白质的相对分子质量答案C解析SDS的作用是使蛋白质完全变性，SDS所带负电荷量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖不同种类蛋白质间电荷差别。知识点二血红蛋白的提取和分离实验操作5.分离血红蛋白时，将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000 r/min的速度离心10 min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层。下列描述中
4、，正确的是()A第1层为无色透明的甲苯层B第2层为红色透明层，含血红蛋白C第4层为白色薄层固体，是脂溶性沉淀物D第3层为暗红色沉淀物，含未破裂的细胞答案A解析第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第3层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液；第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。6关于凝胶色谱柱的装填，除哪项外均为正确解释()A交联葡聚糖凝胶(G75)“G”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值B色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装C用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 hD凝胶用自来水充分溶胀后，
5、配成凝胶悬浮液答案D解析本实验中使用的交联葡聚糖凝胶(G75)，其中G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g，A正确；气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，因此，一旦发现有气泡，必须重装，B正确；在凝胶色谱柱装填完之后，应在约50 cm高的操作压下，用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12小时，以使凝胶装填紧密，C正确；凝胶溶胀时，应使用蒸馏水将其充分溶胀，制成凝胶悬浮液，D错误。7下列对在凝胶色谱柱上加入样品和洗脱的操作的叙述，不正确的是()A加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐
6、B让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面C打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱D待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集答案C解析待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，小心加入缓冲液到适当高度，之后再连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。8在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是()A防止血红蛋白被氧化B血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和C磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D让血红蛋白处在一定的pH范围内，维持其结构和功能答案D解析在血红蛋白的提取过程中，利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH
7、环境，维持血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和研究(活性)。9下列是有关血红蛋白的提取和分离的相关操作，其中正确的是()A可采集猪血作为实验材料B用蒸馏水重复洗涤红细胞C血红蛋白释放后应低速短时间离心D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液答案A解析为防止红细胞吸水涨破，洗涤时要用生理盐水，B错误；释放出血红蛋白后，以2000 r/min的速度离心10 min，C错误；在分离时，要等到红色蛋白质接近色谱柱底端时开始收集流出液，D错误。10下列有关提取和分离猪血红蛋白的实验，叙述错误的是()A用生理盐水洗涤红细胞，以防止红细胞破裂B用蒸馏水和甲苯处理红细胞，使其释放出血红蛋白C用生理盐水透
8、析血红蛋白溶液，以保持血红蛋白活性D用磷酸缓冲液洗脱，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动答案C解析洗涤红细胞时要用生理盐水，以防止红细胞破裂，A正确；在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白，B正确；透析用的是磷酸缓冲液，C错误；洗脱用的是磷酸缓冲液，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动，D正确。能力提升11已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示。下列叙述正确的是()A将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内B若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快C将样品以2000 r/min的速度离心10 min，
9、若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中D若五种物质为蛋白质，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远答案C解析透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不能透过，若分子乙保留在袋内，则分子甲不一定保留在袋内，A错误；用凝胶色谱柱分离蛋白质时，相对分子质量小的物质通过的路程长、移动慢，B错误；离心时相对分子质量大的物质沉淀，若分子戊沉淀，则分子乙、丁、丙均已沉淀，C正确；用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率完全取决于分子大小，故电泳带相距最远的是甲和丙，D错误。12凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，
10、由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果，目前已经在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_，原因是_。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_。(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是_。答案(1)aa相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移
11、动，路程较短，移动速度较快(2)尼龙网和尼龙纱(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)相同保持稳定解析用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱制作时可用尼龙网和尼龙纱代替多孔板。在装填凝胶柱时，不得有
12、气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗脱时要用与浸泡凝胶的液体相同的液体，流速要稳定。13血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。(1)将实验流程补充完整：A为_，B为_。凝胶色谱法是根据_来分离蛋白质的有效方法。(2)洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无法完全除去；离心速度过高和时间过长会使_一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的是_。(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是_。如果红色区带_
13、，说明色谱柱制作成功。答案(1)血红蛋白的释放样品的加入和洗脱相对分子质量的大小(2)杂蛋白(或血浆蛋白)白细胞离心后的上清液不再呈现黄色蒸馏水和甲苯(3)加速样品在凝胶柱中的流动均匀一致地移动解析(1)样品处理及粗分离过程为：红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液透析，凝胶色谱操作过程为：凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的装填样品的加入和洗脱，所以A表示血红蛋白的释放，B表示样品的加入和洗脱，凝胶色谱法的原理是分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。(2)洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白，以利于后续步骤的分离纯化，洗涤次数少，无法
14、除去血浆蛋白，此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净，由于甲苯是表面活性剂的一种，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，蒸馏水能使红细胞涨破。(3)磷酸缓冲液(pH为7.0)能够模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致，洗脱时利用缓冲液，可以加快样品在凝胶柱中的流动，如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。14红细胞含有大量
15、血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2和CO2。我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。根据材料回答下列问题：(1)实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行破碎离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_。(2)在对样品进行处理时，主要包括_、血红蛋白的释放；对样品进行粗分离时主要包括：分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析技术的原理是_。(3)同学甲利用琼脂糖凝胶电泳技术，将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子的_、_以及分子的形状等。而加入SDS后，使得蛋
16、白质的迁移率只取决于_。(4)同学乙利用凝胶色谱法进行血红蛋白的分离(如图1)，他在操作中加样的正确顺序是_，在执行图1中所示操作时，色谱柱下端连接的尼龙管应该_(填“打开”或“关闭”)。(5)图2是同学乙利用样品分离得到的结果，则图2中蛋白质分子量最小的是_。答案(1)防止血液凝固(2)红细胞的洗涤小分子可以自由进出透析袋(半透膜)，而大分子不能通过(3)大小带电性质分子的大小(4)关闭(5)丙解析(1)新鲜血液中加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。(2)样品的处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放等步骤。分离血红蛋白所用的透析方法的原理是半透膜的半透性，即小分子可以自由通过，大分子不能自由通过。(3)琼脂糖凝胶电泳时，影响蛋白质迁移速度的因素有蛋白质分子大小、带电性质及分子的形状等。而加入SDS后，使蛋白质解聚成单链，SDS可以与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使得蛋白质的迁移率只取决于分子的大小。(4)为样品渗入凝胶床内的状态，为样品完全进入凝胶层后加缓冲液到合适高度；为洗脱过程，为装柱后平衡的操作，即正确顺序为；进行所示的环绕加缓冲液时，应关闭下端出口。(5)由图2可看出，丙的洗脱时间最长，分子量应是最小的。
