1、微生物的培养与应用时间：45分钟1(2020全国统一考试仿真一)工业上常用酵母菌来改善酿造酱油的风味，在稀释发酵阶段，由于添加了较多的盐，抑制了大部分微生物的生长，而一些耐盐酵母菌会继续生长，发酵产生乙醇、有机酸等小分子物质，增加酱油的风味。某实验小组从传统发酵酱油中筛选并分离耐盐酵母菌，请回答下列问题：(1)将酵母菌用于酱油发酵过程中，密封的发酵罐要留有一定的空间，其目的是为酵母菌提供氧气，以促进酵母菌的繁殖。(2)若用牛肉膏蛋白胨培养基培养大肠杆菌，则培养基的pH需要调至中性或微碱性。实验室对培养基灭菌的常见方法是高压蒸汽灭菌法。(3)筛选耐盐酵母菌的培养基中需要加入青霉素，其目的是抑制细
2、菌的繁殖。为了保证筛选出的酵母菌具有耐盐性，培养基中还需要加入一定浓度的食盐溶液。酵母菌发酵产生的乙醇与酸性重铬酸钾(试剂)反应会呈现灰绿色，该反应可用于乙醇的检验。(4)在对菌液中的耐盐酵母菌进行计数时，一般要将多个稀释倍数的菌液分别涂布在平板上培养，其目的是保证能从中筛选出菌落数在30300的平板进行计数。解析：(1)将酵母菌用于酱油发酵过程中，密封的发酵罐留有一定的空间，可以为酵母菌提供氧气，促进酵母菌的繁殖，使发酵后期有较多的酵母菌参与无氧呼吸。(2)大肠杆菌适宜的培养基pH应为中性或微碱性。实验室常用高压蒸汽灭菌法进行培养基灭菌。(3)青霉素可以抑制细菌的繁殖。筛选耐盐性的酵母菌，培
3、养基中应加入一定浓度的食盐溶液。酸化的重铬酸钾溶液与乙醇反应会呈现灰绿色，可用于乙醇的检验。(4)在对菌液中的耐盐酵母菌进行计数时，需要从涂布平板中筛选菌落数在30300的平板进行计数，所以要将多个稀释倍数的菌液分别涂布在平板上培养。2(2020湖南长沙模拟)琼脂是一种多糖类物质，由于很少有微生物能将其降解而成为配制固体培养基时常用的凝固剂之一。某实验室在处理一批已进行过微生物培养的废弃固体培养基时发现，几乎全部培养基上的微生物都已死亡，但在其中一个培养基上存在一个正常生长的菌落。对此，研究人员做出了以下假说：此培养基内的营养未被消耗殆尽；形成此菌落的为自养型微生物；形成此菌落的微生物能利用琼
4、脂。(1)从研究人员所作的假说可以推测所说的“营养”指的最可能是碳源(填“碳源”“氮源”或“无机盐”)。(2)配制牛肉膏蛋白胨培养基的步骤包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。倒平板所用的培养皿和培养基所用的灭菌方法依次是干热灭菌和高压蒸汽灭菌。(3)为了检验上述假说是否正确，研究人员分别使用两种培养基对上述微生物进行培养。其中一种为牛肉膏蛋白胨培养基a，则另一培养基b中不能加入下列的AB。A牛肉膏 B蛋白胨 C氯化钠 D琼脂(4)用上述a、b培养足够时间，菌落生长情况为a培养基上长出菌落，b培养基上不长菌落时，证明假说正确。(5)若上述实验否定了假说，为进一步检验假说和，研究人员想要配制一种新
5、的培养基c，并通过b与c上是否出现菌落作为观察指标，则与b相比，c的成分需要做出的变化是将琼脂换用其他凝固剂。解析：(1)从三个假说所指向的微生物来看，其差别主要在于所需碳源不同。(2)培养基配制的基本步骤是计算称量溶化灭菌倒平板，培养皿等玻璃器皿一般采用干热灭菌，而培养基往往采用高压蒸汽灭菌。(3)A、B可以为绝大多数微生物提供碳源，而从实验目的分析，b培养基应该要排除依靠此类碳源生活的微生物，故选A、B。(4)a培养基上长出菌落，b培养基上不长菌落说明该微生物只能利用常规碳源生活，也就说明假说更可靠。(5)要出现菌落，需要用固体培养基，题干提示，琼脂是配制固体培养基时常用的凝固剂之一，因此
6、较为简单的做法是将琼脂换用其他凝固剂，这样就可以通过b和c的对比来确定该微生物能否利用琼脂作为碳源。3(2020广东深圳七校联考)纤维素酶在生产、生活中应用十分广泛，请回答下列问题：(1)一般认为，纤维素酶至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。(2)可以利用分解纤维素的微生物提取纤维素酶，鉴别这类微生物可用刚果红染色法。(3)棉麻织物的主要成分是纤维素，但含纤维素酶的洗衣粉仍可洗涤这类衣物，原因是纤维素酶使棉麻织物的结构变得蓬松，从而使渗入到深处的污垢能够与洗衣粉充分接触，达到很好的去污效果。(4)为提高纤维素酶的利用率，科研人员将纤维素酶与海藻酸钠混合后，滴加到一定浓度的氯化钙溶液
7、中，使液滴形成凝胶珠，该方法称为包埋法。其中氯化钙的作用是使海藻酸钠聚沉，形成稳定的凝胶珠。若凝胶珠中纤维素酶量少，原因可能是海藻酸钠溶液浓度过低。(5)该科研人员进一步探究纤维素酶固定化后的热稳定性变化。将固定化酶和游离酶置于60 水浴中，每20 min测定其活力一次。结果如图所示。据图分析，纤维素酶固定后热稳定性提高，依据是固定化酶活力下降速率小于游离酶。解析：(1)纤维素酶至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种组分。(2)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，故鉴别纤维素分解菌可以用刚果红染色法。(3)用含纤维素酶的洗衣粉
8、洗涤棉麻衣物时，纤维素酶使棉麻织物的结构变得蓬松，从而使渗入到深处的污垢能够与洗衣粉充分接触，达到很好的去污效果。(4)将纤维素酶与海藻酸钠混合后，滴加到一定浓度的氯化钙溶液(使海藻酸钠聚沉，形成稳定的凝胶珠)中，使液滴形成凝胶珠，即为包埋法。若海藻酸钠溶液浓度过低，会导致凝胶珠中纤维素酶量少。(5)据图分析，随着时间的延长，固定化酶活力比游离酶活力下降慢，说明纤维素酶固定化后热稳定性会提高。4(2020广州一测)养殖池中存在的亚硝酸盐能被硝化细菌吸收利用。图甲表示研究人员从养殖池沉积物中分离得到硝化细菌的流程。图乙是选择培养时使用的培养基配方。请回答：(1)图甲中选择培养(步骤二)的作用是筛
9、选出硝化细菌，并增加硝化细菌的浓度。在培养过程中对培养瓶进行振荡的目的是使细胞与培养液充分接触以利于充分吸收营养物质，增加溶解氧。分离纯化(步骤三)时，常采用的接种方法是平板划线法(或稀释涂布平板法)。(2)制备培养液时，应先调节pH再进行灭菌，目的是防止其他微生物污染。制备用于分离纯化(步骤三)的培养基时，图乙所示的配方中还应添加适量琼脂。(3)临时保藏菌种时，可将菌种接种到固体斜面培养基上，在合适的温度下培养，待菌落长成后，将试管放入温度为4_的冰箱中保藏。(4)研究发现硝化细菌吸收利用亚硝酸盐的效果与环境中亚硝酸盐含量有关，若要探究两者的关系，请简要写出实验思路将等量的硝化细菌分别接种到
10、等体积的含不同浓度梯度的亚硝酸盐的培养液中，在适宜条件下培养相同时间后，检测并比较亚硝酸盐的剩余量。解析：(1)进行选择培养的目的是增加目的菌的数量。振荡的目的是增加溶氧量、使菌体与营养物质充分接触。分离纯化常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(2)先调pH后灭菌的目的是防止杂菌污染。分离纯化目的菌需用固体培养基，因此培养基中需添加适量的琼脂。(3)临时保存菌种，应将菌种接种在固体斜面培养基上，在合适的温度下培养，待菌落长出后，将试管放在4 的冰箱中保存。5(2020宁夏平罗中学月考)实现生态农业，让秸秆回归农田的关键是获得能够高效分解秸秆的微生物。请回答下列相关问题：(1)秸秆的主要
11、成分易被纤维素酶分解；从功能上看，筛选能产生该酶的微生物所用的培养基属于选择培养基。(2)甲、乙两组同学设计了两种培养基(成分见下表)：培养基硝酸铵无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水AB注：“”表示有；“”表示无；CR为刚果红。A培养基能(填“能”或“不能”)用于分离要筛选的分解菌，原因是纤维素粉是唯一碳源；加入刚果红(CR)的目的是：CR可与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，培养基上会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈(合理即可)。(3)甲、乙两组同学分别采用稀释涂布平板法和平板划线法接种。甲组同学将1 mL水样稀释100倍后，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，
12、3个平板上的菌落数分别是39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为3.8107个；示意图a和b中，图b是甲组同学接种培养后得到的结果；乙组同学划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是将聚集的菌体逐步稀释，以便获得单个菌落。(4)甲、乙两组同学在微生物接种培养过程中，均留下一个未接种的平板同时培养，目的是作为对照。解析：(1)秸秆的主要成分是纤维素，易被纤维素酶分解；筛选能产生纤维素酶的微生物的培养基属于选择培养基。(2)从表中培养基的成分来看，A培养基能用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是该培养基是固体培养基，且以纤维素粉为唯一碳源。利用刚果红来鉴定纤维素的分解情况，刚果红可
13、与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后无法形成红色复合物，培养基上会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可据此来筛选纤维素分解菌。(3)从示意图看，图b是采用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。根据题意得知每升水样中的活菌数为(393837)30.11001033.8107(个)。图a是采用平板划线法接种培养后得到的结果，划线时总是从上一次划线的末端开始，这样做的目的是通过划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。(4)为了确定培养基的灭菌是否彻底，应设置空白对照：随机取若干灭菌后的空平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。6(2020山东、湖北部分重点中学模拟)
14、从土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌，具有下列类似的操作过程，分析并回答下列问题：(1)在过程的选择培养基是固体培养基，过程的选择培养基是液体培养基(填“固体”或“液体”)。的具体措施是以尿素为唯一氮源；的选择措施是以纤维素为唯一碳源。(2)在过程样品梯度稀释后，一般只将稀释度为104106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。接种的常用方法为稀释涂布平板法(或平板划线法)。(3)过程采用倒平板时加入刚果红染液的鉴别方法较简单。周围出现透明圈但不能100%确定为纤维素分解菌的菌落，原因是不分解纤维素(或分解刚果红或淀粉)的微生物菌落也可能出现透明圈。解析：(1)将微生物接种在固体培养基上培养，才
15、能形成菌落，可见，过程的选择培养基是固体培养基。进行梯度稀释并接种前要进行过程所示的选择培养，因此过程的选择培养基是液体培养基。过程选择培养的目的是筛选尿素分解菌，所以具体的措施是应以尿素为唯一氮源；过程选择培养的目的是筛选纤维素分解菌，所以过程的选择措施是以纤维素为唯一碳源。(2)常采用稀释涂布平板(或平板划线)法，将稀释度为104106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。(3)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶水解后，刚果红纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，过程采用倒平板时加入刚果红
16、染液的鉴别方法较简单。由于不分解纤维素(或分解刚果红或淀粉)的微生物菌落也可能出现透明圈，所以周围出现透明圈的菌落，不能100%确定为纤维素分解菌。7(2020四川眉山一中高三月考)水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇(PVA)是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA 分解菌能产生 PVA酶分解 PVA，PVA 与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当 PVA 被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：(1)要从土壤中筛选出能高效分解 PVA 的细菌，应采用以聚乙烯醇(或PVA)作为唯一碳源的选择培养基，实验中还应设置对照组。将菌液稀释
17、相同的倍数，对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于(填“多于”或“少于”)选择培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。(2)要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用血细胞(血球)计数板直接计数。若将 100 mL含有 PVA 分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取 0.1 mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则 100 mL原菌液中有PVA分解菌1.6109个，该方法的测量值与实际值相比一般会偏小(填“偏大”“偏小”或“相等”)。(3)要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养 PVA 分解菌的培养基中除了加入必需的营养物
18、质外还需要加入碘液用于鉴别 PVA 分解菌。要比较不同菌株降解PVA 能力的大小，用含相同 PVA 浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小(或直径)来确定不同菌株降解 PVA 能力的大小。解析：(1)要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌，应采用以聚乙烯醇(PVA)作为唯一碳源的选择培养基，目的是淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。实验中设置的对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因为对照组没有淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。(2)在显微镜下计数微生物细胞的数量可直接用血细胞计数板计数。根据题意，100 mL原菌液中有PVA分解菌的数目
19、为1600.11041001.6109。由于该方法得到的菌落可能是两个或者多个细菌共同产生的一个菌落，导致统计的菌落数较实际菌落数偏少，所以该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。(3)根据题干中鉴定PVA分解菌的原理“PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑”可知，要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入碘液用于鉴别PVA分解菌。要比较不同菌株降解PVA能力的大小，用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小(或直径)来确定不同菌株降解PVA能力的大小。8
20、(2020河南安阳第一次调研)如图表示研究者从土壤中筛选分解尿素的细菌技术的相关实验，请据图回答下列问题：(1)进行过程和的目的分别是选择培养和增加分解尿素的细菌的数量；图中弧线箭头上“？”的具体操作是挑出菌落。(2)进行培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是先调节pH后灭菌。倒平板时，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，并用记号笔在皿底上标明培养微生物名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及培养基种类等信息。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。(3)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养后，若出现红色就可以鉴定其中含有能够
21、分解尿素的细菌。(4)研究者可以通过观察培养形成的菌落的形状、大小、颜色、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。在实验中，研究者每隔24小时统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足导致遗漏细菌数目。解析：(1)分析题图可知，进行过程和的目的分别是选择培养和增加分解尿素的细菌的数量。图中弧线箭头上“？”的具体操作是挑出菌落。(2)进行培养基配制和灭菌时，为了减少培养过程被杂菌感染的机会，应先调节pH后灭菌。倒平板时，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，并用记号笔在皿底上标明培养微生物名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及培养基种
22、类等信息。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。(3)根据尿素的分解细菌将尿素分解后产生碱性物质氨，氨与酚红指示剂相遇变红的原理，需要在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养后，若出现红色就可以鉴定其含有能够分解尿素的细菌。(4)根据不同细菌形成的菌落特征不同，研究者可以通过观察培养形成菌落的形状、大小、颜色、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。研究者每隔24小时统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足导致遗漏细菌数目。9为探究一种新型抗生素的抑菌效果，研究人员在培养基上打出直径为3 mm的孔，在
23、孔中加入一定浓度的该新型抗生素，并在培养基上接种某细菌，经过一定时间培养后，可以在孔的周围观察到一圈的清晰区，测量清晰区的直径(如图所示)。改变孔中的抗生素浓度和接种的细菌种类重复实验，得到的数据如下表。分析回答下列问题：直径细菌种类浓度大肠杆菌白色葡萄球菌枯草芽孢杆菌5 g/mL7 mm0 mm5 mm7.5 g/mL10 mm5 mm7 mm10 g/mL14 mm8 mm9 mm15 g/mL16 mm13 mm14 mm20 g/mL16 mm17 mm19 mm(1)该实验中将细菌接种于培养基上的方法是稀释涂布平板法，常用的接种工具是涂布器。(2)培养基上的清晰区形成的原因是抗生素抑
24、制细菌生长形成无菌的抑菌圈。(3)要用该新型抗生素控制大肠杆菌感染，该新型抗生素的最适浓度为15g/mL。在控制白色葡萄球菌方面，该新型抗生素具有抑菌作用的最低浓度在7.5 g/mL左右。(4)某人感染枯草芽孢杆菌而患病。欲使用25 g/mL该新型抗生素治疗。该做法合理吗？不合理。理由是没有数据显示25_g/mL该新型抗生素的效果比20_g/mL该新型抗生素好；高浓度的抗生素可能有严重的副作用；滥用抗生素可能会加速细菌产生抗生素抗性(答出一点即可)(答出一点即可)。解析：(1)该实验要使细菌均匀接种到培养基表面，应采用稀释涂布平板法，所用的接种工具是涂布器。(2)由于孔内加入了该新型抗生素，就会在孔周围形成无菌的抑菌圈。(3)由题表可知，对大肠杆菌来说，该新型抗生素的最适浓度为15 g/mL。对白色葡萄球菌来说，7.5 g/mL的该新型抗生素才出现抑菌圈，因此在控制白色葡萄球菌方面，该新型抗生素具有抑菌作用的最低浓度在7.5 g/mL左右。(4)题表中没有数据显示25 g/mL该新型抗生素的效果，不能确定25 g/mL该新型抗生素的效果比20 g/mL时高。而且高浓度的抗生素可能有严重的副作用，滥用抗生素也可能会加速细菌产生抗生素抗性。
