1、第 2 课时 基因工程与克隆技术检测（二十八）“基因工程与克隆技术”点击链接 以文字信息或流程图等形式，综合考查基因工程与细胞工程的原理、操作过程及应用是高考常考形式，题目难度稍大。基因工程中限制酶和 DNA 连接酶的作用特点及在构建基因表达载体中的应用是难点，也是易失分点。考点一 基因工程与蛋白质工程 1(2017全国卷)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA 序列的机制。已知在人体中基因 A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白 A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因 A，以大肠杆菌作为受体细胞却未
2、得到蛋白 A，其原因是_。(2)若用家蚕作为表达基因 A 的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。(3)若要高效地获得蛋白 A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因 A 是否翻译出蛋白 A，可用的检测物质是_(填“蛋白 A 的基因”或“蛋白 A 的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA 是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。解析2(2017全国卷)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解
3、。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提 取 RNA 时，提取液中 需添 加 RNA 酶 抑 制剂，其目的是_。(2)以 mRNA 为材料可以获得 cDNA，其原理是_。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是_。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，
4、根据中心法则分析，其可能的原因是_。解析3.(2016全国卷)某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr或 Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用 BamH酶切后，与用 BamH酶切获得的目的基因混合，加入 DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质 粒 载体 作为 基 因工 程的 工 具，应具 备的 基 本条 件有_(答出两点即可)，
5、而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分 的，其 原 因 是 _；并 且 _ 和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自于_。解析4(2015全国卷)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由 305 个氨基酸组成。如果将 P 分子中 158 位的丝氨酸变成亮氨酸，
6、240 位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留 P 的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_进行改造。(2)以 P 基因序列为基础，获得 P1 基因的途径有修饰_基因或合成_基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和_，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物_进行鉴定。解析1比较记忆基因工程的三种
7、工具(填表)载体 DNA 连接酶 限制酶 质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等 Ecoli DNA 连接酶、T4 DNA连接酶 EcoR 限 制 酶Sma限制酶 常用类型 能在宿主细胞内稳定存在并大量复制有一个至多个_具有特殊的_ Ecoli DNA 连接酶只能连接_T4 DNA 连接酶能连 接_和平末端 识别双链DNA分子的某种_在特定位点上切割 作用特点(条件)两个核苷酸之间的_ 作用部位 携带目的基因进入_ 拼接DNA 片段，形成_ 切 割_和载体 作用 目的基因重组 DNA受体细胞磷酸二酯键特定核苷酸序列黏性末端限制酶切割位点黏性末端标记基因2熟记基因工程的四个操作步骤(填空)(1)目的
8、基因的获取途径：具体操作 方法 以RNA为模板，在_作用下人工合成 逆转录法 已知核苷酸序列的_，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板 化学合成 人工合成 从自然界已有的物种中分离，如从_中获取 直接分离 基因文库较小基因逆转录酶具体操作 方法 原理：_条件：模板DNA、_、脱氧核苷酸、_PCR技术扩增 人工合成 DNA 复制引物热稳定的 DNA 聚合酶过程变性：9095，DNA解旋 复性：5560，与单链DNA结合 延伸：7075，在作用下合成子链引物热稳定的 DNA 聚合酶(2)基因表达载体的构建重组质粒的构建：构建过程：(3)将目的基因导入受体细胞：微生物细胞 动物细胞 植物细
9、胞 原核细胞 _ 受精卵、体细胞 受体细胞 _ 法(用Ca2处理)_技术 _法、基因枪法、_法 常用方法 农杆菌转化花粉管通道显微注射感受态细胞受精卵(4)目的基因的检测与鉴定：3图解记忆蛋白质工程(填图)1(2017泉州市一模)利用基因工程技术培育转基因抗冻番茄。该过程需要用多种限制酶，如图依次表示 EcoR、Sma、Nae三种限制酶的识别序列及切割位点。GAATTC CCCGGG GCCGGCCTTAAG GGGCCC CGGCCG 请回答：(1)上述限制酶在特定位点切割 DNA，其实质是断开 DNA 分子每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_切割后产生了_末端。(2)利用 EcoR和 Na
10、e酶切得某种鱼的抗冻蛋白基因，可与被EcoR 和 Sma 酶 切 后 的 质 粒 连 接 成 重 组 质 粒，原 因 是_。(3)重组质粒 导入番茄后，欲检测抗冻蛋白基因是否转录 出mRNA，需利用_作探针。(4)利用抗冻蛋白制备出相应的_，然后进行抗原抗体杂交，观察到杂交带出现，尚不足以确定转基因抗冻番茄培育是否成功。因此，还应将转基因番茄_，以确定其耐寒能力是否提高。解析2.(2017中山市模拟)植物的抗旱机制很大程度上依赖植物激素脱落酸。2016 年 2 月，中、美两国科学家宣布发现了 PYL9 蛋白(脱落酸的一种受体蛋白)，利用转基因技术实现了启动子 pRD29A 控制 PYL9 过量
11、表达，让水稻自身产生大量 PYL9 蛋白，显著提高了其抗旱性。请回答：(1)已知 PYL9 蛋白的氨基酸序列，培育转基因抗旱水稻可用_法来获得 PYL9 基因。(2)一个 PYL9 基因进行扩增最简便的方法是使用_技术，如果这个过程中消耗了引物 62 个，则进行了_轮的 DNA 复制。(3)科学家通过农杆菌转化法成功培育了该转基因水稻。构建的基 因 表 达 载 体 上 除 了 图 示 标 注 外，还 必 须 含 有_，所填充的这些序列_(填“需要”或“不需要”)全部转入到农杆菌 Ti 质粒的 T-DNA 区域。(4)导入目的基因的重组细胞可通过_技术培育成完整植株。(5)检 测 水 稻 细 胞
12、 是 否 含 有 PYL9 基 因 的 分 子 工 具 是_。从个体水平上检测转基因水稻是否有抗性及抗性程度的方法是_。解析植物体细胞杂交、动物细胞培养、核移植及单克隆抗体制备的过程及应用是高考命题的重点。另外对克隆技术的考查还常以材料或流程图形式，结合基因工程和胚胎工程进行命题，题目的综合性较强，但难度一般。考点二 克隆技术 1(2017全国卷)编码蛋白甲的 DNA 序列(序列甲)由 A、B、C、D、E 五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图 1 所示。回答下列问题：(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的 DNA 序列(TTCGC
13、TTCTCAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_。(2)某同学在用 PCR 技术获取 DNA 片段 B 或 D 的过程中，在 PCR反应体系中加入了 DNA 聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为_，加入了_作为合成 DNA 的原料。解析(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激 T 淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含 T 淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测 T 淋巴细胞浓度，结果如图 2。由图 2 可知：当细胞浓度达到 a 时，添加蛋白乙的
14、培养液中T 淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使 T 淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是_。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的 CO2浓度，CO2的作用是_。仅根据图 1、图 2 可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少_(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激 T 淋巴细胞增殖的效果。2(2016全国卷)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。回答下列问题：(1)图中 A 表示正常细胞核，染色体数为 2n，则其性染色体的组成可为_。过程表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用_的方法。代表的过程是_。(2)经过
15、多次传代后，供体细胞中_的稳定性会降低。因此，选材时必须关注传代次数。(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是_。(4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了_。解析3(2013全国卷)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分 A，乙含有效成分 B。某研究小组拟培育同时含有 A 和 B 的新型药用植物。回答下列问题：(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用_酶和_酶去除细胞壁，获得具有活力的_，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成_组织，然后经过_形成完整的杂种植株。这种培育技术称为
16、_。(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指_。假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是_。(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖，经植物组织培养得到的_等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。解析1比较记忆植物组织培养与动物细胞培养(填表)动物细胞培养 植物组织培养 项目 过程 _或出生不久的幼龄动物的_ 植物_ 取材 幼嫩部位 动物胚胎 器官或组织 动物细胞培养 植物组织培养 项目 蛋白质生物制品的生产皮肤移植材料的培育检测有毒物质生理、病理、药理学的研究 植株快速繁殖脱毒植株的培养人工种子生产药物、杀虫剂等转基因植物的培育 应用 无菌、无
17、毒营养物质，_等温度和Ph气体环境：_ 无菌营养物质适宜条件 条件 获得新的细胞，不 _，不体现全能性 获得植株个体，可以体现_ 结果 10111213全能性 形成个体 血清 O2、CO22理清克隆动物培育流程(填图)动物细胞融合 植物体细胞杂交 项目 过程 细胞膜的_ 细胞膜的_、细胞的_ 原理 流动性 全能性 流动性 3比较记忆植物体细胞杂交与动物细胞融合(填表)动物细胞融合 植物体细胞杂交 项目 3比较记忆植物体细胞杂交与动物细胞融合(填表)突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能 克服了远缘杂交的_，获得杂种植株 意义 杂交细胞 杂种植株 结果 除物理法和化学法外还可以用诱导 物理
18、法：离心、电激、振动；化学法：聚乙二醇等试剂诱导 融合方法 或胶原蛋白酶 纤维素酶和_ 相关酶 果胶酶 胰蛋白酶 灭活的病毒 不亲和性 4准确记忆单克隆抗体的一过程两特点(填空)(1)制备过程：(2)单克隆抗体的特点：、灵敏度高。特异性强 1(2017银川模拟)回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面_时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的_。此时，瓶壁上形成的细胞层数是_。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，常用的酶是_。(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现_的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会
19、因遗传物质发生改变而变成_细胞，这种细胞的黏着性_，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量_。解析(3)用某种大分子染料对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是_。(4)检查某种有毒物质是否能改变细胞染色体的数目，最好选用分裂到_期的细胞用显微镜进行观察。(5)在细胞培养过程中，通常在_条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中_的活性降低，细胞新陈代谢的速率很低。(6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤当作_进行攻击。2(2017长春调研)絮凝性细菌在拟核 DNA 的控制下，分泌的具有絮凝活性的高分子化合物，能与石油污水中的悬浮颗粒和有机物等
20、形成絮状沉淀，起到净化污水的作用。为进一步提高对石油污水的净化效果，将絮凝性细菌和石油降解菌(相关基因在细胞质)融合，构建目的菌株。其流程如下。据图回答：(1)溶菌酶的作用是_。PEG 的作用是_。(2)经处理后，在再生培养基上，未融合的 A、B 难以生长。图中 AB 融合菌能生长和繁殖，原因是成功融合的细胞既可以_，又可以_。(3)目的菌株的筛选：筛选既能分泌具有絮凝活性的化合物，又能在含有_的培养基上生长的 AB 融合菌，其同化作用类型应为_型，属于生态系统中的_(填成分名称)。(4)为探究目的菌株不同发酵时间发酵液的絮凝效果，将目的菌株进行发酵培养，定时取发酵液，加入石油污水中，还应设置
21、_为对照组。解析1(2017华南师大附中三模)华蟾素是我国经典抗肿瘤药物。研究人员为探寻华蟾素注射液抗肝癌细胞的作用机理，进行了一系列实验。请回答下列问题：.肝癌细胞的培养：(1)培养肝癌细胞时，在培养基中加入适量的_以补充合成培养基中缺乏的物质，为防止培养过程发生污染要加入_。此外，每 48 h 更换 1 次培养液，目的是_；同时还要提供适宜的温度、_、氧气和二氧化碳等环境条件。.探究华蟾素药效作用机理的实验：(2)DNA 拓扑异构酶(简称 Topo)为真核生物所必需，在DNA 复制、转录等方面发挥重要作用，Topo在肿瘤细胞中含量明显高于正常细胞。华蟾素注射液处理细胞 48 h 后，采用逆
22、转录聚合酶链式反应技术检测 Topo基因的表达情况，结果如表。华蟾素浓度(g/mL)0 0.10 0.20 0.40 Topo基因表达量 解析逆转录聚合酶链式反应的主要原理是：提取肝癌细胞中的总 RNA，在_酶的作用下合成 cDNA，再以 cDNA 为模 板 进 行PCR扩 增，为 完 成 该 反 应 还 需 要 添 加_。由上可知，华蟾素注射液在分子水平上影响肝癌细胞的机理是_。2(2017南京三模)图 1 是利用两种不同生物技术将小鼠培育成大鼠的过程。图 2 中质粒是基因工程中常用的质粒 pIJ702，其中tsr 为硫链丝菌素抗性基因，mel 是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变
23、成黑色菌落；而限制酶 Cla、Bgl、Pst、Sac、Sph在 pIJ702 上分别只有一处识别序列。pIJ702 pZHZ8 Bgl 5.7 kb 6.7 kb Cla 5.7 kb 2.2 kb,4.5 kb Pst 5.7 kb 1.6 kb,5.1 kb(1)图 1 中应用到的生物工程技术有_。c 分子称为_，其上的生长激素基因表达产物的受体分布在丁鼠的全身细胞的_。(2)若大鼠甲和大鼠乙体内 X 染色体上均带有某种致病基因，则培育出的大鼠丙和大鼠丁携带致病基因的是_(不考虑基因突变)。表 1(3)用 Sac和Sph同时切割大鼠生长激素基因和质粒 pIJ702，获取的目的基因去置换 p
24、IJ702 上 0.4 kb 的片段，构成重组质粒pZHZ8。上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在表 1 中。由此判断目的基因的片段长度为_kb。参照表 1 数据，如果用 Pst和 Cla同时酶切重组质粒 pZHZ8，则两种酶可将 pZHZ8 切成_个片段。(4)重组质粒 pZHZ8 上的标记基因是_，在含硫链丝菌素固体培养基上培养后，筛选过程中要淘汰_色的菌落。解析3(2017天津市红桥区模拟)DHA 对脑神经发育至关重要。以 A、B 两种单细胞真核藻为亲本，利用细胞融合技术选育高产 DHA融合藻。两种藻特性如下表。亲本藻 优势代谢类型 生长速率g/(Ld)固体培养基上菌落直径 DHA含量(
25、%)A藻 自养 0.06 小 0.7 B藻 异养 0.14 大 无 据表回答：(1)选育的融合藻应具有 A 藻_与 B 藻 _的优点。(2)诱导融合前需用纤维素酶处理两种藻，其目的是获得_。(3)通过以下 a、b、c 三步筛选融合藻，步骤_可淘汰 B 藻，步骤_可淘汰生长速率较慢的藻落，再通过步骤_获取生产所需的融合藻。步骤 a：观察藻落的大小；步骤 b：用不含有机碳源(碳源生物生长的碳素来源)的培养基进行光照培养；步骤 c：测定 DHA 含量。(4)以获得的融合藻为材料进行甲、乙、丙三组实验，结果如下图。与甲、丙两组相比，乙组融合藻生长速率较快，原因是在该培养条件下_。甲、乙两组 DHA 产量均较高，但实际生产中往往采用甲组的培养条件，其原因是_。解析
