1、实验6-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测课标解读重点难点1.制备固定化-淀粉酶。 2.进行淀粉水解的测定。3.通过此实验探讨固定化酶的应用价值。1.固定化酶的方法和优点。2.固定化酶装柱后的使用。一、酶与固定化酶1酶活细胞产生的具有催化作用的一类有机物，它是生物体内各种化学反应的催化剂。2固定化酶将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。3将酶改造成固定化酶的原因由于酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用，所以要将酶改造成固定化酶。4酶固定化的方法吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。本实验用的是吸附法。5固定化酶作用的机理将固定化酶装柱，当底物经
2、过该柱时，在酶的作用下转变为产物。在酶固定化的各种方法中，哪一种方法对酶的作用影响较小？【提示】吸附法二、-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用检测的实验1实验目的(1)制备固定化-淀粉酶。(2)进行淀粉水解作用的检测。2实验原理将-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂测试，若流出物呈红色，表明糊精生成。3本实验使用的酶及特性本实验使用的酶是枯草杆菌的-淀粉酶，其作用的最适pH为5.57.5，最适温度为5075_。4实验材料及其制备(1)-淀粉酶的固定化：在烧杯中将5 mg -淀粉酶溶于4 mL蒸馏水中(由于酶不纯，可能有些不溶物) 再加入5 g石
3、英砂，不时搅拌30 min 30 min后将上述溶液装入1支注射器中(该注射器的下端接有气门心，并用夹子封住) 用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为1 mL/min(2)可溶性淀粉溶液：取50 mg可溶性淀粉溶于100 mL热水中，搅拌均匀。(3)KI-I2溶液：称取0.127 g碘和0.83 g碘化钾。加蒸馏水100 mL，完全溶解后装入滴瓶中。5实验步骤(1)淀粉溶液流经固定化酶柱将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，使该溶液以0.3 mL/min的流速过柱。(2)接取流出物待从固定化酶柱中流出5 mL淀粉溶液后，接收0.5 mL流出液。
4、(3)流出物鉴定在流出物中加入KI-I2溶液，观察颜色。用水稀释1倍后再观察颜色。(4)洗涤、保存固定化酶柱实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱。放置在4 冰箱中保存。(5)几天后取出冰箱中该固定化酶柱，重复实验，观察结果。固定化酶柱为什么放在4 的冰箱中保存？【提示】高温会破坏酶的结构，低温不破坏酶的结构。酶的固定化1.固定化酶的概念酶是生物体内各种化学反应的催化剂，具高度专一性和高效性，但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质(如石英砂、毛玻璃、琼脂糖、明胶、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等)上，使之成为不溶于水而又有酶活性的
5、制剂。2酶的常用固定化方法酶的固定化可分为酶分子固定化及细胞固定化。细胞固定化与直接固定酶相比，成本更低，操作也更容易。常用方法如下：(1)物理吸附法物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性炭、多孔玻璃、石英砂等。(2)化学结合法(包括交联法及共价偶联法等)化学结合法是指将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖、离子交换树脂等载体上的固定方式。工艺简便及条件温和是其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子材料。化学结合法中常见的有交联法、共价结合法、离子结合法等。(3)包埋法包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝
6、胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化法，前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。固定酶的方法3直接使用酶和固定化酶的比较直接使用酶固定化酶酶的种数一种或几种一种常用载体石英砂、高岭土、皂土、硅胶、凝胶制作方法化学结合法固定化、物理吸附法固定化催化反应单一或多种单一反应底物各种物质(大分子、小分子)各种物质(大分子、小分子)缺点对环境条件非常敏感，易失活；难回收，成本高，影响产品质量不利于催化一系列的酶促反应优点催化效率高、耗能低、污染低既能与反应物接触，又能与产物分离；可以反复利用4.固定化酶的优点(1)可循环反复使用酶制剂。在某些情况下可使用上千次，极大地
7、降低了生产成本。(2)在生产中，可通过离心法或过滤法把酶与反应液相互分开，在大规模的生产中所需工艺设备比较简单易行。(3)稳定性能好。下列与固定化酶相关的叙述中正确的是()A固定化酶是将水不溶性酶固定于某种介质上，使之成为易溶于水，而又具酶活性的制剂B将固定化酶装柱，当酶流过该柱时，可催化柱内底物转变为产物C酶固定的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等D固定化酶的缺点是酶在水溶液中很不稳定，且易与产物混在一起不易分离【思路点拨】固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学方法固定在某种介质上。使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。与普通酶相比，固定化酶易与产物分离，且固定化酶反应柱中酶已被固定，不
8、能从柱内流出；酶的固定化方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。【答案】C关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法错误的是()A固定化酶生物活性强，可长久使用B一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高C一般酶制剂参加反应后不能重复利用D固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量【解析】固定化酶是将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用，降低成本，产物中也不含酶，提高了产品的纯度，固定化酶虽可以多次利用，但不可长久使用。【答案】A固定化酶的应用1.用固定化酶技术生产高果糖浆(1)高果糖浆生产中面临的问题：高果糖浆的
9、生产需要使用葡萄糖异构酶，它能将葡萄糖转化成果糖。这种酶的稳定性好，可以持续发挥作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。(2)固定化酶反应柱将酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些颗粒装在反应柱内，反应柱底端装上分布着许多小孔的筛板，酶颗粒无法通过小孔，而反应溶液却能出入。(3)使用固定化酶技术生产高果糖浆。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。(如图所示) (4)相关技术优势：上述反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。目前，用固定化葡萄糖异构酶生产高
10、果糖浆的规模已经超过了每年1 000万吨。2-淀粉酶的固定化(1)固定方法用吸附法将-淀粉酶固定在石英砂上。在烧杯中将5 mg -淀粉酶溶于4 mL蒸馏水中，再加入5 g石英砂，不时搅拌，30 min后，装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4 mL)。用10倍体积的蒸馏水洗涤注射器以除去未吸附的游离淀粉酶。(2)固定化-淀粉酶功能检测原理：淀粉糊精 (遇碘显蓝色)(遇碘显红色)麦芽糖葡萄糖(遇碘不显色)检测：用吸附法将-淀粉酶固定在石英砂上制成反应柱后，将反应柱(注射器)放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，当一定浓度的淀粉溶液流经反应柱时，柱内的-淀粉酶可使淀粉水解成糊精
11、用淀粉指示剂(KI-I2溶液)测试，流出物呈“红色”表明有淀粉水解产物糊精的生成(未水解时，淀粉遇其指示剂应显示蓝色)。固定化酶在消除污染、保护环境方面的应用：固定化酶和固定化细胞在清除污染、保护环境方面也大有作为，是当代环境保护的出色“卫士”，其主要作用是进行环境监测和处理三废。环境监测：固定化酶也可以用于测定有毒物质的含量，进行环境监测，如用固定化多酚氧化酶检测水中的酚类物质；利用固定化酶还可以检测有机磷、有机氯农药等环境污染物(如过氯酸盐、氧化物和尿素等)处理三废：应用固定化酶或固定化细胞可以组成快速、高效、连续运行的污水处理系统，如用固定化分解氰化物的细菌除去废水中的氰化物；用固定化-
12、淀粉酶处理造纸厂的废水，用水解农药的细菌固定化制剂处理农药废水等。下图为固定化酶的反应柱示意图，请据图回答：(1)请在横线上填出各标号名称。_，_，_。(2)与一般酶制剂相比，固定化酶的突出优点是_。(3)的作用是_。(4)制作固定化葡萄糖异构酶所用的方法有_或_。(5)据图说出反应柱的作用原理：_。【思路点拨】(1)固定化酶反应柱是将酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些颗粒装在反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板，酶颗粒无法通过小孔，而反应液却可出入，图示中为反应柱，为固定化酶，为具有小孔的筛板。(2)固定化酶的突出优点是既能与反应物接触，又能与产物分离。(3)多孔筛板的作用在于阻止酶
13、颗粒通过，但却让反应液自由出入。(4)固定化酶可采用吸附法、交联法等方法。(5)反应柱的作用原理在于反应物溶液从反应柱上端注入后，使反应物流过反应柱与固定化酶接触，参与催化化学反应所形成的产物则从柱的底端流出。【答案】(1)反应柱固定化酶分布着小孔的筛板(2)既能与反应物接触，又能与产物分离，能连续性生产(3)酶颗粒无法通过，反应溶液却可自由出入(4)吸附法交联法(5)反应物溶液从反应柱上端注入，使反应物溶液流过反应柱，与固定化酶接触，得到的产物从反应柱下端流出。【互动探究】若上述(例2)反应柱中，所固定的酶为-淀粉酶，注入的溶液为一定浓度的淀粉溶液，请回答：(1)注入淀粉溶液后，反应柱底端流
14、出物中主要成分是什么？你如何检测淀粉是否被水解？现象如何？(2)该流出物溶液中是否具有-淀粉酶？为什么？如何通过简单实验，验证你的结论？【提示】(1)流出物主要成分是糊精，可用淀粉指示剂检测淀粉是否被水解，其现象是：水解前溶液呈蓝色，水解后溶液呈红色。(2)流出物溶液中无-淀粉酶，因为反应柱底端的多孔筛板只允许反应物溶液自由出入。而酶分子不能通过。为证明上述结论，可在装入反应物溶液前，先向柱内加入蒸馏水，收集柱底端流出物溶液进行淀粉水解实验加入蒸馏水后的流出物溶液不能将淀粉水解，表明其内无淀粉酶。1下列不属于酶固定化的方法的是()A吸附法B共价法C交联法D包埋法【解析】本题考查酶固定化的方法。
15、酶固定化的方法比较多，其中包括吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等。本题四个选项中B项的方法描述不准确。【答案】B2固定化酶的优点是()A有利于增加酶的活性 B有利于产物的纯化C有利于提高反应速度D有利于酶发挥作用【答案】B3将固定化酶装柱后，当底物经过该柱时，底物发生的变化是()A底物被稀释了B底物被浓缩了C底物的结构变得更加稳定了D底物被酶水解成产物了【解析】固定化酶装柱后，当底物经过该柱时，底物被酶水解成产物了。所以只有D选项是正确的。【答案】D4淀粉在各种酶的作用下会依次水解，不同阶段的水解产物遇到指示剂会出现不同的显色反应，下列选项中属于本实验中的反应物质和显色现象的是()A淀粉遇碘
16、显蓝色B糊精遇KI-I2溶液显红色C麦芽糖遇碘不显色D葡萄糖遇斐林试剂显砖红色【解析】本题考查本实验步骤中物质的鉴定过程。该过程所依据的原理是淀粉流经-淀粉酶固定化酶柱时，淀粉被酶水解成了糊精，而糊精遇到KI-I2溶液显红色。所以A、C、D选项中的反应物质都是错误的，不是淀粉、麦芽糖、葡萄糖，而是糊精。只有选项B正确。【答案】B5回答下列有关固定化酶技术的问题。(1)酶是生物体中生化反应的催化剂，在工业生产和食品加工中的应用日益广泛。为提高酶的利用率以及提高产品的纯度，一般需要对酶进行固定化处理：即将酶用物理或化学方法固定在_介质上，具体方法有：吸附法、共价偶联法、_法和交联法。(2)下图为装
17、有固定化酶a的实验装置。其中b是反应柱，c是催化底物。若装置中的固定化酶为-淀粉酶，则通常是利用吸附法进行固定的，介质一般为_。利用该装置进行淀粉水解实验时，在漏斗中加入反应液后的操作是_，以保证反应充分。对流出的液体用_检测，若呈现_色，说明淀粉被水解成糊精。若a是固定化酵母，要想得到较多的酒精，加入反应液后的操作是_，装置中的长导管起的作用是_。 (3)研究认为，用固定化酶处理污染物是很有前途的，如将从大肠杆菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的_。A温度 B水分CpHD营养【解析】(1)固定酶的介质应为非水溶性
18、物质。(2)固定-淀粉酶的方法为石英砂吸附法。-淀粉酶装柱后进行淀粉水解实验时，应打开活塞1和活塞2，并控制流速，保证-淀粉酶的催化作用。检测淀粉是否被分解为糊精应用KI-I2溶液。如果反应柱中加入的是固定化的酵母细胞，利用酵母细胞生产酒精时，应在无氧条件下进行。弯曲的长导气管既可以排出无氧呼吸产生的CO2，也可以防止杂菌进入反应柱。(3)固定化酶降解有机磷农药不需要营养。【答案】(1)非水溶性包埋(2)石英砂打开活塞1和2，并控制流速KI-I2溶液红关闭活塞1和2排放气体CO2，防止杂菌进入反应柱(3)D学业达标测评(四)-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测1.淀粉在有关酶的作用下依次生成的
19、物质是()糊精葡萄糖果胶麦芽糖蔗糖ABCD【解析】淀粉的水解过程如下：淀粉糊精麦芽糖葡萄糖其中依次生成的物质是糊精、麦芽糖、葡萄糖，果胶和蔗糖都是没有的。【答案】D2下图所示的酶固定化技术中，属于包埋法的一组是()A BCD【解析】包埋法固定化酶是指将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中，可分为凝胶包埋法和微囊化法，故应选D。【答案】D3对固定化酶中用到的反应柱的理解，正确的是()A反应物和酶均可自由通过反应柱B反应物和酶均不能通过反应柱C反应物能通过，酶不能通过D反应物不能通过，酶能通过【解析】酶被固定不能通过。【答案】C4用吸附法将-淀粉酶固定在石英砂上
20、，当一定浓度的淀粉溶液流过固定化酶柱后，柱底端收集到的溶液中，加入KI-I2溶液，其颜色变化为()A显蓝色B显红色C不显色D流出液中因含淀粉酶，使得溶液颜色显紫色【解析】一定浓度的淀粉溶液流过固定化-淀粉酶酶柱后，淀粉可转化为糊精，糊精遇KI-I2溶液显红色，酶经固定化后，不能从柱底端流出。【答案】B5下列关于固定化酶的说法正确的是()A酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用B酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远利用下去C酶由于被固定在载体上，所以丧失了高效性和专一性D被固定化的酶其活性部位完整，所以不受高温，强碱、强酸等条件的影响【解析】固定化酶可以被反复利用，但并非能永远利
21、用下去。故B项错误；固定化酶是将酶分子结合在特定支持物上且不影响酶的功能，不会使酶丧失高效性和专一性，故C项错误；固定化酶的活性仍受温度、pH等环境条件的影响，故D项错误。【答案】A6下列有关固定化技术的叙述，正确的是()A固定化酶只是在细胞内才能发挥作用B固定化酶能提高酶的利用率C酶的固定是酶分离纯化的常用方法D固定化酶的固定化方式就是吸附在固体表面上【解析】制成固定化酶的步骤是：酶的生产、提取、酶的分离纯化、酶的固定化。制成固定化酶的方法有：使酶吸附在固体表面；将酶相互连接起来；将酶包埋在细微的网格里等。这样的固定化酶能重复利用，从而提高了酶的利用率。而酶在条件适宜时，既可在细胞内起作用，
22、也能在细胞外起作用，制成的固定化酶，主要在细胞外发挥作用。【答案】B7现在生产的许多饮料和糖果中的甜味剂不是蔗糖而是高果糖浆，高果糖浆是淀粉通过一系列的催化作用转化而来的，下列哪一种酶在这一过程中是不需要的()-淀粉酶糖化淀粉酶葡萄糖异构酶纤维素酶-淀粉酶A BCD【解析】由淀粉转化为果糖的过程及相关酶可表示如下：淀粉糊精麦芽糖葡萄糖果糖。【答案】D8目前，有一些酶制剂能够大批量生产与工业化应用，能够实现大量生产的酶主要有淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶等，它们主要来自微生物。微生物有很强的生命力，适应能力强，可保证酶的大批量生产。我们都知道，蔗糖几乎全部是通过加工甘蔗或甜菜得到的。但是，
23、甘蔗和甜菜的种植范围都比较有限，因此，蔗糖的产量也就受到了影响。能不能利用淀粉来生产类似蔗糖的物质呢？科学家通过-淀粉酶、糖化酶和固定化葡萄糖异构酶，将淀粉转化成和蔗糖具有同样甜度的甜味剂高果糖浆。(1)微生物可保证酶的大批量生产的原因是什么？(2)在葡萄糖的异构反应中，如果不将葡萄糖异构酶固定化，而是直接使用葡萄糖异构酶，会对生产过程产生哪些影响？(3)生产上具体采用哪些方法制成固定化葡萄糖异构酶？(4)科学家为了解决酶易发生变性、不易重复使用等问题，是如何做的，试简述之。【解析】微生物细胞表面积与体积比相对较大，细胞与外界物质交换充分，代谢效率较高，故可保证酶的大批量生产，葡萄糖异构反应中
24、，若不将葡萄糖异构酶固定化，会导致酶易与产物混合在一起，导致纯度不高，且不易重复使用，因此生产上常将酶进行固定化。【答案】(1)微生物繁殖能力强，适应能力强。(2)酶和产物混合在一起，产物的纯度不高，并且酶不能重复使用。(3)将葡萄糖异构酶吸附到离子交换树脂上；将葡萄糖异构酶包埋在明胶中。(4)将酶以一定的方式固定在某种载体上，制成固定化酶，这样生产原料从载体的一端流入，产品就从载体的另一端流出，而酶可以重复使用。9请回答下列有关酶及酶固定化的有关问题：(1)在工业生产中，为提高酶的使用效率和产品纯度，一般需要将酶进行固定化处理。利用石英砂固定-淀粉酶的方法属于_。A吸附法B偶联法C交联法D包
25、埋法(2)一定浓度的淀粉溶液流过-淀粉酶固化柱后，被水解成_，遇碘显_色。(3)-淀粉酶可以通过枯草杆菌发酵生产，以下是利用诱变育种方法培育获得产生较多淀粉酶的菌株的主要实验步骤。(原理：菌株生长过程可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈)第一步：将枯草杆菌菌株接种到_培养基上进行扩大培养。第二步：将枯草杆菌菌株分成两组，A组用_处理，B组不处理(作对照)。第三步：制备多个含淀粉的固体培养基。第四步：将A、B组分别稀释后，分别在含淀粉的固体培养基上利用_法分离，适宜条件下培养得到单菌落。第五步：观察A、B组各菌落周围的_。实验结果预期：根据诱发突变率低的特点，预期_。根据诱发突变不定向性的特点，预期_。【答案】(1)A(2)糊精红(3)液体诱变剂涂布透明圈大小A组多数菌落周围的透明圈与B组差异不显著A组有少数菌落周围的透明圈比B组明显小，有少数比B组明显大(或A组透明圈大小不一，B组较一致)
