1、第17课时多聚酶链式反应扩增DNA片段目标导航1.知道细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；知道DNA合成方向。2.理解PCR的原理；掌握PCR的基本步骤及每个步骤前后发生的变化。一、PCR技术的原理1PCR扩增方向(1)3端和5端：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为_，而含_的末端称为_；一个双链DNA分子中含两个3端和两个5端，如果一条链的方向是_，则另一条链的方向就是_，这就是反向平行的含义。(2)DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过_相连，该化学键是由一分子脱氧核苷酸中3号碳原子上的羟基(OH)，与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳原子上的磷酸基团脱
2、水聚合而成。所以DNA的合成方向总是从子链的_向_延伸。2PCR技术原理(1)PCR原理：DNA分子在一定条件下可以进行半保留复制。(2)DNA的热变性原理：在_的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为_；当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为_。3生物体内DNA复制与PCR反应的区别体内复制PCR反应解旋在_作用下，细胞提供能量，部分解开加热至_，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的_开始，都是连续合成，控制温度_特点_，半保留复制体
3、外迅速扩增Taq DNA聚合酶_循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要_、_作原料、_，子链延伸的方向都是从_到_，且都需要在一定的缓冲溶液中进行二、PCR的反应过程1反应条件(1)稳定的缓冲液环境。(2)DNA模板。(3)分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物。(4)A、T、G、C四种脱氧核苷酸。(5)耐高温的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。(6)能严格控制温度变化的温控设备。2过程(1)_(9095)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。(2)_(55左右)：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，形成局部
4、双链。(3)_(72左右)：在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的5端3端延伸合成与模板互补的DNA链。3结果(1)PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也做模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈_。(2)PCR一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为_。三、PCR反应的实验操作流程1操作步骤_：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上_：用微量移液器按照配
5、方在微量离心管中依次加入各组成成分_：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁_：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目的是使反应液集中在离心管底部_：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应2操作提示(1)避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行_。(2)缓冲液和酶分装成小份，并在_储存。(3)每添加一种反应成分，更换一个_的枪头。(4)混匀后离心处理，使反应液集中在_底部。3实验中DNA含量的测定理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后的数目为2n，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。(1)原理DNA在260 nm的紫外
6、线波段有一强烈的吸收峰。峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。(2)过程稀释：2 L PCR反应液，加入98 L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。测定：取DNA稀释液100 L至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。计算：DNA含量(g/mL)50(260 nm的读数)稀释倍数。知识点一PCR的原理和反应过程1DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是()2在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA
7、分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是()循环次数不够Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制引物不能与模板链结合系统设计欠妥A B C D知识点二PCR的实验操作3在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：a链5GGTC35GGOH(引物)b链3CCAG5_(引物) 955GGTC33CCAG5 555GGTC33CCAG5 5GGOH 72_(1)在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适
8、的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是_；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为_。4有关下列操作过程的叙述，错误的是()APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换一、选择题1下列有关PCR的描述，不正确的是()A是一种酶促反应B引物决定了扩增的特异性CPC
9、R反应中的目的片段一般以2n指数扩增D扩增对象是氨基酸序列2DNA的复制需要引物，其主要原因是()A可加快DNA的复制速度B引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C引物的5端有助于DNA聚合酶延伸DNA链DDNA聚合酶只能从3端延伸DNA链3变性作用是指核酸双螺旋结构被破坏，双链解开，但共价键并未断裂。引起变性的因素很多，升高温度、过酸、过碱以及加入变性剂等都能造成核酸变性。PCR的反应过程中，引起变性的因素是()ApH 过高 BpH 过低C升高温度 D加入酒精4PCR技术扩增DNA，需要的条件是()目的基因引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等mRNA核糖体A BC D5用15N标记的一个DNA分
10、子放在含14N培养基中复制三次，含15N的DNA分子占全部DNA分子的比例和含15N的DNA单链占全部DNA单链的比例依次是()A1/4,1/6 B1/4,1/8C1/2,1/8 D1/2,1/46下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物()A第一次循环 B第二次循环C第三次循环 D第四次循环7关于DNA聚合酶催化合成DNA子链的说法中，正确的是()A以DNA为模板，使DNA子链从5端延伸到3端的一种酶BTaq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加CDNA聚合酶能特异性地复制整个DNA的全部序列DTaq DNA聚合酶是从深海生态系统中发现的8使用PCR仪具体实验操作顺序应
11、为()设计好PCR仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部A BC D二、简答题9下图是PCR技术示意图，请回答下列问题：(1)标准的PCR过程一般分为_、_、_三大步骤。(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一小段_。(3)将双链DNA_，使之变性，从而导致_。(4)引物延伸需提供_作为原料。10PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，操作步骤简介如下：第步：准备“汤”和模板DNAA配制多聚酶链式反应“汤”注：SPU是一种溶液的计量单位；矿物油可防止聚合酶在冻结时受伤害，以保证酶的活性；dNTP
12、有四种：dATP、dGTP、dCTP、dTTP。B准备要拷贝的DNA如要拷贝自己的DNA可以用一牙签轻刮口腔内壁，将牙签放入蒸馏水中摇动。加热使蒸馏水沸腾，使细胞破碎释放出DNA。用离心机离心后，去除蒸馏水中较大的细胞碎片。这时上清液中就有了较纯的DNA。第步：多聚酶链式反应将DNA(B)放入汤(A)中。水浴加热。首先，95 ，使DNA双螺旋打开，历时1 min；然后，55，使引物结合到DNA上，历时30 s；最后，72 ，与DNA聚合酶结合使DNA复制，历时1 min。重复步骤。每重复一次，即完成一次拷贝。根据上述操作过程回答下列问题：(1)以上材料可以说明()ADNA的复制必须在活细胞中才
13、能完成BDNA能指导蛋白质的合成C在合适的条件下，非细胞环境也能进行DNA的复制DPCR技术是一种无性生殖技术(2)若用人体细胞内的遗传物质做PCR扩增，则扩增后的几百亿个DNA分子起码可分为46种。要将其分开，可用电泳、染色等技术，常用的试剂有溴化乙锭等。有些试剂毒性较强，因此应戴上化学实验专用手套作为保护措施，以免其与皮肤接触。溴化乙锭是一种强烈的诱变物，若接触皮肤活细胞，很可能会引起()A基因重组B该个体会产生变异较大的后代C癌变D皮肤外层是死细胞，该物质接触皮肤后对人体不会有影响(3)PCR技术中用到的DNA聚合酶，取自生长在热泉中的一种细菌。就PCR技术来讲，你认为使用这种细菌中提取
14、的酶较普通的动植物体内提取的DNA聚合酶的优势是_。(4)PCR技术能将某一DNA分子扩增成许多相同的DNA片段，原因是：DNA分子具有_结构；DNA复制时遵循_原则。(5)DNA分子进行扩增时，除了所要扩增的DNA片段外，还需要四种_、_和_等条件。若已知DNA的一条单链的碱基组成为ATCCGAT，则与它互补的另一条单链的碱基组成为_。第17课时多聚酶链式反应扩增DNA片段知识清单一、1.(1)3端磷酸基团5端3553(2)35磷酸二酯键5端3端2(2)80100变性复性3解旋酶95引物端72边解旋边复制不需要需要模板四种脱氧核苷酸酶5端3端二、2.(1)变性(2)复性(3)延伸3(1)指数
15、扩增(2)230三、1.准备移液混合离心反应2(1)高压灭菌(2)20(3)移液器(4)离心管对点训练1CPCR反应中DNA的扩增数目和生物体内的DNA复制是类似的，即1个DNA分子复制一次，变为2个，复制2次，产生4个DNA分子，呈指数扩增，开始有一个DNA分子的模板，经过n次复制后得到的DNA分子的数量为2n，与曲线C相符合。规律链接扩增后，循环次数与DNA总数间的有关计算问题在进行PCR扩增后，若以一个DNA片段作为模板，经n次循环后DNA分子总数为2n；若N个DNA片段作模板，经n次循环后DNA分子总数为N2n。2D该现象属于在PCR扩增中假阴性现象。其原因有：(1)Taq DNA聚合
16、酶活力不够或其活性受到抑制导致催化效率降低，得到的产物比预期的少；(2)引物设计不合理，可能不能与模板DNA结合，导致无法进行扩增；(3)提取的模板数量或质量不过关，不起模板作用，无法进行扩增；(4)PCR系统设置不妥，达不到预期的效果；(5)循环次数过少，产物的量比预期的少。3(1)5GAOH5GGTC33CCAG5 HOAG55GGOH 72(2)3CCAG53CCAG55GGTC35GGTC3(3)每个DNA分子各有一条链含32P标记1/2n解析(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，所以引物就提供了3端，子链延伸方向53，引物与b链部分碱基互补，引物则与a链部
17、分碱基互补，且连接到a链的3端，故引物的结构为5GAOH，复性结果为： HOAG55GGTC3(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物和引物。(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/(2n2)1/2n。联想PCR扩增的方向总是从子链5端向3延伸，所以子链的一端需要引物。规律链接PCR扩增需要注意的问题1DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为2030
18、个核苷酸。2当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50左右时，引物与模板可结合，一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因是：(1)模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。(2)引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会。(3)加入的引物的量足够大，而模板链数量少。4C在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C错误。联想为避免外源DNA污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须高压灭菌，每添加一种反应成分更换一个移液器的枪头，混合后离心处理，使反应液集中在离心管底部。达标测试1DPCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术
19、，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原料，在引物作用下使DNA聚合酶从引物的3端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量ya2n，a代表模板DNA量，y代表DNA片段扩增后的理论拷贝数，n代表循环次数；在扩增过程中，被扩增的是DNA序列，而不是氨基酸序列，因此D项错误。2DDNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从5端开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸D
20、NA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3延伸。3C各选项的条件均能导致DNA分子变性，但在PCR反应中，变性后还要进行复性和延伸等过程，过酸、过碱、酒精等会导致反应过程中的酶变性失活，使DNA扩增不能进行，因此，在PCR反应中，选用升高温度使DNA变性。4APCR技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料。5BDNA是半保留复制，复制一次形成两分子DNA，每条DNA都含有一条15N和14N单链；复制两次，形成四个分子，含15N的只有两分子DNA；复制三次形成的八个DNA分子中含15N的仍是两分子。这时DNA
21、单链有十六条，含15N的只有亲代的两条。6A在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。7ADNA聚合酶不能从头开始催化合成DNA，而只能从DNA单链的3端延伸子链；Taq DNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可反复利用，无需另外再添加；PCR扩增的是引物之间的固定长度的DNA序列；Taq DNA聚合酶是1966年从
22、美国黄石公园的一个热泉中发现的。8CPCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配置配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应，因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。9(1)变性复性延伸(2)单链DNA或RNA(3)加热到95双链DNA分离成两条单链(4)四种脱氧核苷酸10(1)C(2)C(3)耐高温，在较高的温度下不变性(4)规则的双螺旋碱基互补配对(5)脱氧核苷酸能量酶TAGGCTA解析(1)在合适的条件下，细胞外也可完成DNA复制。(2)溴化乙锭是一种化学诱变物，在DNA的复制过程中，诱发基因突变，可能导致细胞发生癌变。(3)PCR技术要在较高的温度下进行，所以使用的DNA聚合酶要耐高温，在较高的温度下不变性。(4)DNA规则的双螺旋结构和碱基互补配对原则使DNA能够复制出与其完全相同的子代。(5)DNA分子复制时，不仅需要DNA片段，还需要四种游离的脱氧核苷酸、能量、酶等条件。由碱基互补配对原则可知，其互补链的碱基组成为TAGGCTA。
