1、第3 章第1节 重组DNA技术的基本工具生物内 容 索 引自主预习 新知导学合作探究 释疑解惑课堂小结课标定位素养阐释1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.进行DNA的提取和鉴定实验。1.结合基因工程的基本原理,形成“基因工程赋予生物新的遗传特性”的生命观念。2.独立进行DNA的粗提取和鉴定实验,提升科学探究能力。自主预习 新知导学一、基因工程的诞生和发展1.基因工程的概念:是指按照人们的愿望,通过转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生
2、物类型和生物产品。从技术操作层面看,由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫作重组DNA技术。2.基因工程的基础:在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的。3.基因工程的问世:1973年,科学家证明质粒可以作为基因工程的载体,构建重组DNA,导入受体细胞,使外源基因在原核细胞中成功表达,并实现物种间的基因交流。至此,基因工程正式问世。4.基因工程的发展(连线)二、重组DNA技术的基本工具1.限制性内切核酸酶(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)功能:能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(3)限制酶的切
3、割方式限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开,产生的是黏性末端。如:EcoR限制酶识别的序列和切割位点如下图所示。限制酶在它识别序列的中心轴线处切开,产生的是平末端。如:Sma限制酶识别的序列和切割位点如下图所示(图中虚线为中轴线)。2.DNA连接酶(1)作用:将两个DNA片段连接起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。(2)主要种类:E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。(3)两类DNA连接酶的比较:E.coliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来,T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接
4、平末端的效率相对较低。3.基因进入受体细胞的载体(1)质粒本质:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。作为载体的条件:a.有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中。b.进入受体细胞后,能在细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制。c.常有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。(2)其他载体:噬菌体、动植物病毒等。三、DNA的粗提取与鉴定1.实验原理(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
5、(3)在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。2.材料用具:(略)3.方法步骤(1)提取:称取约30 g洋葱,切碎,研磨过滤(除杂质,取上清液)析出DNA(在上清液中加入预冷的酒精溶液,静置23 min,溶液中出现的白色丝状物,即粗提取的DNA。用玻璃棒卷起白色丝状物,吸去水分;或离心,取沉淀物,晾干)。(2)鉴定【预习检测】1.判断正误。(1)限制酶只能用于切割目的基因。()(2)限制酶切割DNA分子具有特异性。()(3)某限制酶切割DNA后可产生黏性末端或平末端。()(4)DNA连接酶能使两碱基通过形成氢键连接起来。()(5)E.coli DNA连接酶既可“缝合”平末端,又可“缝合”黏
6、性末端。()(6)质粒是小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体。()(7)载体的作用是携带目的基因进入受体细胞中,使之稳定存在并表达。()(8)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。()2.实施基因工程的最终目的是()A.提取生物体的DNA分子B.对DNA分子进行人工剪切C.在生物体外对DNA分子进行改造D.创造符合人们需要的新的生物类型和生物产品答案:D解析:A、B和C三项均为基因工程操作的具体内容,但不是基因工程的目的。实施基因工程的最终目的是通过基因操作定向改造生物的遗传物质,创造出符合人们需要的新的生物类型和生物产品。3.关于限制酶识别序列和切开部位的特点,下列叙述错误的是()A.
7、所识别的序列都可以找到一条中轴线B.中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的C.只识别和切割特定的核苷酸序列D.在任何部位都能将DNA切开答案:D4.两个核酸片段在适宜条件下,经X酶的催化作用发生下图所示的变化。则X酶是()A.DNA连接酶B.RNA聚合酶C.DNA聚合酶D.限制酶答案:A解析:图中X酶可将两个具有互补黏性末端的DNA片段连接在一起,因此该酶为DNA连接酶。5.作为基因工程中的“分子运输车”载体,下列哪项不是其必须具备的条件?()A.必须有一个至多个限制酶切割位点,以便目的基因可以插到载体上B.必须具备自我复制的能力,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制C.必须
8、带有标记基因,以便进行重组后的筛选D.都含氨苄青霉素抗性基因答案:D解析:载体必须带有标记基因,以便进行重组后的筛选,但不一定都含氨苄青霉素抗性基因。合作探究 释疑解惑问题引领知识点一 限制性内切核酸酶1.限制酶的识别序列有什么特点?提示:大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。限制酶所识别的序列为回文序列(两条链从5到3方向的序列一致),都有一条中轴线。2.限制酶虽然主要存在于原核生物中,但对原核生物自身DNA不会起到切割作用,这是为什么?提示:原核生物自身DNA上不存在限制酶的识别序列和切割位点。3.解旋酶和限制酶作用的键一样吗?提示:不一样。解旋酶作用于互补配对的碱基之间的氢键,限制酶作
9、用于两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。4.结合教科书第71页图3-3,分析黏性末端和平末端是如何形成的。提示:限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开,就形成黏性末端。在识别序列的中心轴线处切开,就产生平末端。归纳提升1.限制酶能识别特定的核苷酸序列,并把特定位点的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,但并不是都只识别一种核苷酸序列。2.比较DNA酶、解旋酶、限制酶酶作用产物DNA酶断开相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,水解DNA形成四种脱氧核苷酸解旋酶解旋,断开双链互补碱基之间的氢键DNA单链限制酶识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条
10、链中特定部位的磷酸二酯键断开黏性末端或平末端3.限制酶是一类酶,不是一种酶,具有专一性。不同种类的限制酶识别序列和切割位点不同,具有专一性,但不同限制酶切割后可能形成相同的黏性末端。典型例题下表所示为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点,注:Y=C或T,R=A或G。由此推断以下说法正确的是()A.限制酶切割后不一定形成黏性末端B.限制酶的切割位点一定在识别序列的内部C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列答案:A解析:由表中信息可知,Hind限制酶能识别4种不同的核苷酸序列,D项错误。Sau3A限制酶的切割位点在识别序列的外部,B项错
11、误。BamH限制酶与Sau3A限制酶切割后能形成相同的黏性末端,C项错误。Sma限制酶切割后产生的是平末端,A项正确。【变式训练】1.下表为几种限制酶的切割位点,下列相关叙述错误的是()A.限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键B.BamH切割的序列能被Bcl切割C.Bcl切割的序列能被Sau3A切割D.以上信息说明限制酶具有特异性和专一性答案:B解析:分析题中表格可知,限制酶BamH的识别序列为GGATCC,且在GG之间进行切割;Bcl的识别序列为TGATCA,且在TG之间进行切割;Sau3A的识别序列为GATC,且在G前面进行切割。BamH切割的序列与Bcl切割的序列不同,所以BamH切割
12、的序列不能被Bcl切割。2.下列黏性末端是由同一种限制酶切割而成的是()A.B.C.D.答案:C解析:限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。限制酶识别的核苷酸序列在两条链上顺序颠倒,切割后形成的黏性末端能够互补配对。图中能够互补,其他的不能互补,所以是由同一种限制酶切割而成的。问题引领知识点二DNA连接酶1.DNA连接酶通过形成什么化学键把两个DNA片段连接起来?提示:通过形成磷酸二酯键将两个DNA片段连接起来。2.常用的两类DNA连接酶的作用有什么区别?提示:E.coliDNA连接酶只能“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,T
13、4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。归纳提升1.DNA连接酶主要包括E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。E.coliDNA连接酶只能“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端的效率相对较低。这两类酶“缝合”时都能形成磷酸二酯键。2.DNA聚合酶与DNA连接酶的比较酶DNA聚合酶DNA连接酶形成磷酸二酯键的方式只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上,形成磷酸二酯键是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键是否需要模
14、板以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过形成磷酸二酯键合成一条与模板链互补的DNA链将DNA双链上的两个缺口同时连接起来,因此,DNA连接酶不需要模板是否需要引物 需要引物不需要引物典型例题下列有关DNA连接酶的说法,正确的是()A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样,能连接单链DNA片段C.E.coliDNA 连接酶可以连接有平末端的DNA片段,也能连接有黏性末端的DNA片段D.T4DNA连接酶只能连接有平末端的DNA片段答案:A解析:DNA连接酶连接的是双链DNA片段,而DNA聚合酶只能将单个脱氧核
15、苷酸加到已有的核苷酸片段上。E.coliDNA连接酶只能连接有黏性末端的DNA片段。T4DNA连接酶可以连接有平末端的DNA片段,也能连接有黏性末端的DNA片段。【变式训练】基因工程离不开DNA连接酶,下列有关叙述错误的是()A.DNA连接酶起作用时,不需要模板B.基因工程中的“分子缝合针”只有T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶C.DNA连接酶通过形成磷酸二酯键连接双链DNA片段的缺口D.T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端答案:B问题引领知识点三 基因进入受体细胞的载体1.质粒为什么能充当“分子运输车”?提示:质粒具备载体的
16、条件:(1)有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段插入其中。(2)进入受体细胞后,能在细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制。(3)带有标记基因,便于重组DNA分子的筛选。2.标记基因是怎样起筛选作用的?提示:标记基因是一种已知功能或已知序列的基因,通常是一些抗生素抗性基因或表达产物有特定颜色的基因,可将受体细胞接种于特定的培养基上,通过观察受体细胞是否有特定抗性或颜色等判断载体是否进入受体细胞。3.为什么基因工程中用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的?提示:一般来说,天然质粒往往不能满足人类的所有要求,因此人们根据不同的目的和需求,对某些天然的质
17、粒进行人工改造。归纳提升1.载体的作用(1)用它作为运载工具,将目的基因送入受体细胞。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。2.作为载体的必备条件(1)有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段插入其中。(2)具备自我复制能力,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制。(3)带有标记基因,便于重组DNA分子的筛选。3.载体的种类(1)细菌质粒,它是细菌拟核DNA之外的小型环状双链DNA分子,有的细菌只有一个,有的细菌有多个。(2)噬菌体。(3)动植物病毒。4.质粒载体与天然质粒的区别质粒载体是在天然质粒的基础上人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记
18、基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切核酸酶识别位点的序列,并去掉了大部分非必需序列,使相对分子质量尽可能小,以便于操作。典型例题下图是某质粒的结构示意图(a、b、c代表外源基因可能的插入位点)。下表是外源基因插入某位点后含重组质粒的细菌在不同培养基上的生长情况。请根据表中提供的细菌的生长情况,推测三种重组细菌的外源基因插入位点,正确的一组是()A.是c;是b;是aB.是a和b;是a;是bC.是a和b;是b;是aD.是c;是a;是b答案:A细菌细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长的情况细菌在含四环素的培养基上生长的情况 能生长能生长 能生长不能生长 不能生长能生长解析:细菌在两
19、种培养基上都能生长,说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都没有被破坏,外源基因插入位点是c点;细菌在含氨苄青霉素的培养基上能生长,在含四环素的培养基上不能生长,说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,四环素抗性基因被破坏了,外源基因插入位点是b点;细菌在含四环素的培养基上能生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能生长,说明氨苄青霉素抗性基因被破坏了,四环素抗性基因没有被破坏,外源基因插入位点是a点。【变式训练】1.下列可作为“分子运输车”的是()天然质粒 人工改造的质粒 噬菌体的衍生物 动植物病毒A.B.C.D.答案:C解析:天然质粒需要经过改造才能成为基因工程的“分子运输车”。2.(不定项选择题)下列
20、有关质粒的叙述,错误的是()A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B.细菌质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子C.质粒只有在侵入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的答案:ACD问题引领知识点四DNA的粗提取与鉴定1.提取大分子物质的基本思路是什么?提示:提取生物大分子的基本思路是将被分离的生物大分子与其他物质分开,并加以纯化。对于DNA的粗提取而言,就是要利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。2.如何用乙醇析出DNA?提示:由于DNA不溶于酒精,在过滤得到的上清液中加入等体积
21、的95%的预冷酒精即可使DNA析出,然后用玻璃棒慢慢卷起丝状的DNA。3.如何用二苯胺鉴定DNA?提示:取两支20 mL的试管,各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后,向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后,比较两支试管中溶液颜色的变化。归纳提升1.DNA粗提取与鉴定的原理(1)粗提取DNA的原理:DNA不溶于冷酒精溶液,但是某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。(2)鉴定
22、DNA的原理:在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。2.实验材料的选择凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。不能用哺乳动物的成熟红细胞,原因是哺乳动物的成熟红细胞内无细胞核。3.破碎细胞,获取含DNA的滤液的方法动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要先溶解细胞壁,再进行充分的研磨,过滤后收集研磨液。4.析出DNA在一倍体积的上清液中倒入体积相等的冷却的酒精溶液,溶液中析出白色丝状物。预冷的酒精溶液的作用:抑制核酸水解酶的活性,防止DN
23、A水解;降低分子运动,使DNA易于析出;低温有利于增加DNA的柔韧性,减少断裂。典型例题下图为菜花DNA的粗提取与鉴定的实验流程图。据图回答下列问题。(1)选择菜花作为提取DNA实验材料的原因是。(2)研磨前,向研钵中加入石英砂的目的是,加入的物质a是。(3)研磨液过滤后,应向滤液中加入预冷的酒精溶液,目的是;也可以向滤液中加入少量蛋白酶,目的是。(4)鉴定DNA所用的化学试剂为。在该鉴定实验中,A试管溶液不变蓝,B试管溶液变蓝,由此可知,A、B两支试管属于对照组的是,对照组试管中加入的物质有。答案:(1)菜花中的DNA含量相对较高(2)使研磨充分 研磨液(3)析出DNA,溶解部分杂质 分解蛋
24、白质(4)二苯胺 ANaCl溶液和二苯胺试剂解析:(1)菜花中DNA含量相对较高,可以作为提取DNA的材料。(2)向研钵中加入石英砂是为了使研磨更充分。在本实验中同时向研钵中加入一定量的研磨液,可以瓦解细胞膜,有利于DNA的释放。同时,研磨液中含一定的NaCl,有利于DNA的溶解。(3)在含有DNA的滤液中,加入预冷的酒精溶液,可以使DNA析出、溶解部分杂质;蛋白酶能分解滤液中的蛋白质。(4)鉴定DNA的原理是在沸水浴条件下,DNA与二苯胺反应呈现蓝色,因此鉴定DNA所用的化学试剂为二苯胺。B试管中溶液呈现蓝色,说明含有DNA,所以属于对照组的是A试管。对照组试管中加入的物质有NaCl溶液和二
25、苯胺试剂,目的是排除NaCl溶液对二苯胺显色的影响。【变式训练】1.关于利用新鲜的洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是()A.向洋葱组织中加入蒸馏水并搅拌即可释放核DNAB.加入研磨液的作用是瓦解细胞膜,但不溶解DNAC.利用DNA不溶于冷酒精的特性,可粗提取DNAD.含DNA的NaCl溶液与二苯胺试剂在常温下混合呈蓝色答案:C解析:洋葱细胞为植物细胞,有细胞壁保护,因此加蒸馏水不会使洋葱细胞吸水涨破。加入研磨液的作用是瓦解细胞膜,并能溶解DNA。利用DNA不溶于冷酒精的特性可粗提取DNA。含DNA的NaCl溶液与二苯胺试剂在沸水浴下混合呈蓝色。2.有关DNA粗提取与鉴定的实验,下列说法错误的是()A.实验材料可选择哺乳动物的肝,不能选择哺乳动物的血液B.粗提取DNA的原理之一是DNA与蛋白质在体积分数为95%的酒精中的溶解度不同C.鉴定DNA的原理是DNA遇二苯胺试剂即变蓝色D.沸水浴条件下,提取的丝状物遇二苯胺试剂会染成蓝色答案:C课堂小结
