1、考点1基因工程的理论基础及操作工具(5年19考)(2013全国大纲卷、广东理综)1基因工程的概念基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达结果人类需要的基因产物或生物类型优点可定向改造生物的遗传性状2.基因工程的基本工具(1)(2)DNA连接酶常用类型EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端或平末端结果都缝合磷酸二酯键，如图(3)基因进入受体细胞的载体类型对载体的分析条件目的稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的
2、标记基因便于重组DNA的鉴定和选择易错提醒(1)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。(2)常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色的表达产物的基因和荧光基因等。(3)不同限制酶切出的黏性末端未必不同，如GGATCC和GATC识别的序列不同，但处理后形成的黏性末端相同。思考感悟限制酶为何不切割其所在生物自身的DNA?提示限制酶不切割原核生物自身DNA的原因：原核生物DNA序列中不存在该酶的识别位点或识别序列已经被修饰。基因工程的理论基础及操作工具1(2012全国新课标，40)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核
3、酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有_和_。(2)质粒运载体用EcoR切割后产生的片段如下：AATT CG GCTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即_DNA连接酶和_DNA连接酶。(4)反转录作用的模板是_，产物是 。若要在体外获得大量反转录产物，常采用_技术。(5)基因工程中除质粒外，_和_也可作为运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是 _。答案(1)平末端黏性末端
4、(2)切割产生的DNA片段末端与EcoR切割产生的相同(3)T4Ecoli(4)mRNA(或RNA)cDNA(或DNA)PCR(聚合酶链式反应)(5)动植物病毒噬菌体的衍生物(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱基因工程中限制酶的选择问题2(江苏卷，2T)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHHind EcoRSma识别序列及切割位点 GGATCCCCTAGG AAGCTTTTCGAA GAATTCCTTAAG CCCGGGGGGCCC(1)一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后，分别含有_个游离的磷
5、酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma 切割，原因是_。(4)与只使用EcoR相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_。(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。解析本题综合考查基因工程的过程及应用。(1)质粒是双链环状D
6、NA分子，在Sma 切割前没有游离的磷酸基团，Sma 作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键，切割产生的DNA片段末端是平末端，因而质粒经切割后含有2个游离的磷酸基团。(2)质粒的热稳定性主要由氢键的数量决定，氢键数量越多，质粒的热稳定性越高，反之则低，DNA双链中A与T之间存在2个氢键，C与G之间存在3个氢键，因此DNA分子中GC碱基对越多，热稳定性就越高，Sma 识别CCCGGG序列，并在C和G之间将这段序列切开，也就是质粒中Sma 酶切位点越多，GC碱基对越多，热稳定性越高。(3)据图1可知，Sma 切割的位点在抗生素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图2可知Sma 切
7、割的位点在目的基因之中，破坏了目的基因，所以不能使用Sma 切割。(4)用同种限制酶切割后的质粒和目的基因，在基因表达载体构建时，常形成三种连接方式，其中目的基因与目的基因的连接、质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。(5)基因表达载体的构建过程中需加DNA连接酶，连接脱氧核糖和磷酸。(6)抗生素抗性基因属于标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(7)目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因而可在含有蔗糖(唯一碳源)的培养基中培养。答
8、案(1)0、2(2)高(3)Sma会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞(7)蔗糖为唯一含碳营养物质题后归纳1限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子磷酸二酯键脱氧核苷酸DNA热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核聚合酶DNA水解酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部分解为两条长链RNA聚合
9、酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端2.限制酶选择的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma 会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
