1、实验1 大肠杆菌的培养和分离指结构简单,形体微小的单细胞、多细胞或无细胞结构的低等生物。一、微生物微生物的类群病毒病毒细菌细菌蓝细菌蓝细菌放线菌放线菌酵母酵母霉菌霉菌原生动物原生动物病毒病毒原核生物原核生物真菌真菌原生动物原生动物（1）结构：（2）繁殖方式：（3）变异类型：（4）应用：1、细菌：拟核区基因突变、基因重组基因工程、遗传实验材料（1）概念：（2）作用：2、菌落：鉴定菌种33、培养基：、培养基：（1）类型：按物理性质分液体培养基固体培养基凝固剂琼脂扩大培养，工业生产分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏LB培养基营养培养基天然培养基合成培养基33、培养基：、培养基：（2）成分及其作用：成分作
2、用主要来源碳源主要作能源物质无机碳(CO2)或有机碳(糖类)氮源合成含N类化合物N2，NH3，铵，硝酸盐尿素，牛肉膏，蛋白胨无机盐调节渗透压等水生长因子调节促生长维生素，AA，碱基等二、无菌操作1、概念：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。2、无菌操作包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近 旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品 相接触。（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程；不能杀死芽孢和孢子。3、消毒与灭菌的概念及
3、两者的区别（2）灭菌：以化学或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。3.常用的消毒与灭菌的方法：（1）消毒法：A、煮沸消毒法:100煮沸5-6minB、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min（牛奶）C、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源D、紫外线消毒（空气）（2）常用灭菌的方法：高压蒸汽灭菌：培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具高压蒸汽灭菌锅1kg/cm2、121下维持15min酒精灯灼烧灭菌：接种环等金属器具1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以
4、下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。三、分离细菌方法1、划线分离法11）灼烧接种环；）灼烧接种环；22）接种环冷却后，蘸取带菌培养物）接种环冷却后，蘸取带菌培养物33）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养基上划线。基上划线。2、涂布分离法1)稀释菌液（10-5 10-7倍）用无菌吸管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍
5、的稀释液。2)涂布用无菌吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。3)培养：将培养皿倒置，在37恒温箱中培养2448h。划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。四、大肠杆菌的培养和分离1、大肠杆菌（1）特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌（2）用途：基因工程技术中被广泛采用的工具2、培养：LB液体培养基 扩大培养LB液体培养基 分离3、分离培养基灭菌制作平板扩大培养划线分离菌种保存将LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将灭菌后冷却到60的LB固
6、体培养基倒入灭菌过的培养皿中，制作平面培养基.将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基中，然后在37摇床中震荡培养12h。用接种环取震荡培养后的菌液，并在固体培养基上划线，然后将划线后的培养皿倒置与37的恒温培养箱中培养1224h，观察划线末端的菌落生长情况.用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在37的恒温培养箱中培养24h，再放入4的冰箱中保存。1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培
7、养基。3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃
