1、一、微生物的实验室培养1培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的。(2)成分：一般都含有碳源、氮源、水和无机盐，还需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。2无菌技术营养基质煮沸消毒法灼烧灭菌3实验操作(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备计算溶化灭菌。称量倒平板(2)微生物的分离方法平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面的操作，将聚集的菌种逐步分散开来。稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到表面，进行培养。连续划线琼脂固体培养基二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1分离原理：土壤中细菌之所以能分解尿素，是由
2、于它们体内能合成，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。2统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用。3实验流程：土壤取样制备微生物的培养与观察 细菌的计数。脲酶稀释涂布平板法培养基三、分解纤维素的微生物的分离1纤维素酶一种复合酶，它包括、和，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。2纤维素分解菌的筛选原理(1)可以与纤维素形成红色复合物，但并不和发生这种反应。(2)纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。C1酶Cx酶葡萄糖苷酶刚果红纤维二糖和葡萄糖3土壤中纤维素分解菌的筛选实验流程土壤取样将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生的菌
3、落。选择培养梯度稀释透明圈考点一培养基的配置与应用命题解读 培养基的制备与应用是历年高考的热点，又是微生物培养与应用的基础，其中选择培养基的作用是考查的重点。新课标省份的考题多以简答题的形式出现，分值比重加大，但难度不大，预计2012年高考中将延续这种趋势。示例1 如下所示为培养某种微生物的培养基的配方，请回答：成分含量NaNO3K2HPO4KClMgSO47H2OFeSO4CH2OH2O青霉素3 g1 g05 g05 g001 g30 g1 000 mL01万单位(1)依物理性质，该培养基属于_培养基；依用途划分，则属于_培养基。(2)根据培养基原料，所培养微生物的同化作用的类型是_，培养的
4、微生物可能是_。(3)该培养基中的碳源是_。不论何种培养基，在各成分都溶化后分装前，要进行的是_和_；倒平板时，一般需冷却至_左右，在_附近操作。(4)若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去的物质是_，至少应加入的物质是_，为检测纤维素分解菌的存在与否还应加入_，形成_色复合物，若产生_，则证明有纤维素分解菌存在。解析(1)从培养基成分看，没有琼脂等凝固剂，属于液体培养基；从用途上分析，加入青霉素可以杀死细菌、放线菌，选择出霉菌、酵母菌等属于选择培养基。(2)该生物以培养基中的(CH2O)作碳源，为异养型微生物。(3)考查微生物培养的基本操作。(4)培养纤维素分解菌，是以纤维素作碳源，故应去除(
5、CH2O)；培养细菌应去除能杀灭细菌的青霉素。可用刚果红与纤维素形成红色复合物，检测纤维素分解菌的存在。若存在，菌落周围会形成透明圈。答案(1)液体 选择(2)异养型 酵母菌或霉菌(3)(CH2O)调整pH 灭菌 50 酒精灯火焰(4)青霉素和(CH2O)琼脂和纤维素粉 刚果红 红 透明圈划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产固体培养基加凝固剂，如琼脂微生物分离、鉴定等1培养基的类型划分标准培养基种类特点用途用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，用来抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养和分离出特定微生物(如分离酵母菌和霉菌，可以在培养基中加入青霉素)
6、鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈深紫色并带有金属光泽)(1)加入培养基中的凝固剂(如琼脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。(2)选择培养基一般只生长具有特定目的的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。2微生物的营养营养要素含义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机化合物：O2NaHCO3；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等营养要素含义作用主要来源氮源凡能提供所需氮元
7、素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机物化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是()A计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D计算、称量、灭菌、溶化、倒平板解析：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。答案：C2现有两种固体培养基，已知其配制时所加的成分如下表：KHSO4 MgSO4NaClCaSO4 CaCO3 葡萄糖淀粉甲培养基 0.02%0.0
8、2%0.02%0.01%0.5%0.5%2%乙培养基 0.02%0.02%0.02%0.01%0.5%00用这两种培养基分别分离土壤中的两种微生物，你认为它们适于分离()A甲培养基适于分离自养型自生固氮菌；乙培养基适于分离异养型自生固氮菌B甲培养基适于分离酵母菌；乙培养基适于分离真菌C甲培养基适于分离异养型自生固氮菌；乙培养基适于分离自养型自生固氮菌D甲培养基适于分离异养型共生细菌；乙培养基适于分离异养型共生固氮菌解析：根据所提供的甲、乙两种培养基的成分分析，两者之间的主要差别是：甲培养基以葡萄糖和淀粉作为有机碳源和能源，也有少量的无机碳源(CaCO3)；乙培养基无有机碳源和能源。两者之间的共
9、同点是：都不含氮源。说明这两种培养基只能培养具有固氮能力的微生物。答案：C考点二微生物培养的实验室操作命题解读考题多以非选择题的形式出现，考查微生物的培养条件、代谢特点，实验室微生物培养规范和主要步骤。预计2012年高考命题将通过生产生活中有关微生物计数、微生物分离与培养等实际问题考查培养基消毒灭菌等基础知识。示例2(2009宁夏高考)(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 _、_ 和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_ 等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行 _(消毒、灭菌
10、)；操作者的双手需进行清洗和 _；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的 _。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过 _ 处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。解析 解答本题需要识记微生物的培养条件、代谢特点，实验室微生物培养规范和主要步骤。微生物
11、的培养条件有适宜的营养物质(碳源、氮源、无机盐等)、温度、pH、渗透压(控制培养液的浓度)等。细菌具有个体微小、结构简单、生长周期短、繁殖快、代谢旺盛、变异类型简单(主要是基因突变)等特点。在微生物实验操作中，防止杂菌污染是贯穿实验整个过程中的内容，因此，对环境、生物材料、操作者双手等进行消毒，对培养基、接种环和培养仪器进行灭菌等是微生物实验中的常见操作。紫外线灭菌的原理是紫外线的高能量使蛋白质和DNA等生物分子变性，即空间结构改变。稀释涂布平板法是细菌分离纯化的常用方法，合适的稀释倍数是实验的关键。答案(1)温度 酸碱度 易培养 生活周期短(2)灭菌 消毒 损伤DNA的结构(3)比例合适(4
12、)鉴定(或分类)(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生(6)灭菌1消毒与灭菌条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌用酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。若浓度过高，菌体表面蛋白质凝成一层保护层，则乙醇分子不能渗入其中；若浓度过低，杀菌能力减弱。2无菌技术具体操作(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接
13、种用具和培养基等进行灭菌。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。3倒平板的注意事项(1)若培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，应废弃该平板；(2)手试刚不烫手时(50)倒平板；(3)在酒精灯火焰附近操作，防污染；(4)冷凝平板倒置，防皿盖冷凝水落到培养基上造成污染。4纯化大肠杆菌(1)常用方法：平板划线法和稀释涂布平板法。(2)平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。(3)平板划线操作 第一次划线与第二次划线之前都需灼烧
14、灭菌，划线操作、结束时仍需灼烧接种环。划线时最后一区域不要与第一区域相连。灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液以免温度过高杀死菌种。3(2011青岛质检)微生物与人类关系密切。虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的。请回答下列问题。(1)培养微生物的培养基配方中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。从土壤中分离分解尿素的细菌时，培养基中加的唯一氮源为_，这种培养基称为_ 培养基。(2)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，为什么要将平板倒置？_。(3)微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和_ 法。在用平板划线法接种时，为什么在操作的第 一步以及每次划线之前都
15、要灼烧接种环_。在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么_。解析：从土壤中分离出分解尿素的细菌，需用选择性培养基，唯一的氮源是尿素。接种过程中，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法两种方法。每次划线前都要灼烧接种环的目的是杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落。操作的第一步和最后一步需灼烧接种环的目的分别是防止接种环上有其他微生物而污染培养基、以免菌种对环境造成污染和感染操作者。答案：(1)尿素 选择(2)皿盖上会凝有水珠，防止水珠落入培养皿造成污染，还可使培养基表面的水分更好地挥发(3)稀释涂布平板 第一步灼烧接
16、种环是防止接种环上有其他微生物而污染培养基。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落(4)需要，以免菌种对环境造成污染和感染操作者示例下面是探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数的实验，完成下列问题：(1)实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基，盛9 Ml无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、
17、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。(2)方法步骤：倒平板：分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，操作过程应在火焰旁。制备土壤稀释液：取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至9 mL 的无菌水的大试管中，依次稀释到107稀释度。涂布：按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布_个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布1个平板。培养：放入恒温箱内，在2830下培养34天。细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在 _ 的平板进行计数。如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌落数是
18、_。(稀释度是105)(3)预测结果：相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落数应多于无氮培养基上的数目。请说明原因。解析分离自生固氮微生物，应用无氮培养基，因为氮是生物必需的元素，只有具有固氮能力的自生固氮微生物才能在无氮培养基上生长。而营养全面的牛肉膏蛋白胨培养基则允许多种微生物生长。答案(2)3303005107(3)无氮培养基上能生存繁殖的仅是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存。1筛选菌株的原理在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源，只有能够利用尿素的微生物才能够生长；把纤维素作为培养基中的唯一碳源，只有能够利用纤维素的微生物才能够生长；无
19、氮源的培养基上，只有自生固氮菌才能够生长。2统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300 的平板进行计数。计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。3该实验中的注意事项(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。(2)对照原则判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
