1、课题1 DNA的粗提取与鉴定教材内容解读要点1 提取DNA的方法（1）分离选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。（2）DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl的浓度变化，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。选择适当的盐溶液就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA会析出。DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影
2、响。大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而DNA在80以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。（4）DNA的鉴定在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。要点2 实验设计（1）实验材料的选取选用DNA含量相对较高的生物组织，如鸡血。（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。植物细胞需要先用洗涤剂溶解细胞膜。（3）去除滤液中的杂质方法有三种：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析
3、出DNA过滤去除溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。直接在滤液中加入嫩肉粉反应1015分钟，嫩肉粉中的木瓜蛋白质酶能够分解蛋白质。将滤液放在6075的恒温水浴箱中保温1015分钟。（4）DNA的析出与鉴定析出较纯净的DNA将处理后的溶液过滤，加入与溶液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置23分钟，溶液中会出现白色丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加
4、热5分钟，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。溶解有DNA的溶液变蓝。要点3 实验案例案例一以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取课前准备本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。教师可以到市场售活鸡处索取鸡血，所带烧杯中必须提前放入抗凝剂柠檬酸钠溶液。具体制备方法如下。取质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约180mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯
5、中的血液置于冰箱内，静置1d，使血细胞自行沉淀。有条件的学校也可以将血液倒入离心管内进行离心，用2000r/min或3000r/min的转速，离心2min，使血细胞沉淀于离心管底部，这样可以使血细胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。值得注意的是鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。提取DNA的具体步骤1.破碎细胞，释放DNA鸡血细胞中的DNA与核蛋白结合，位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下是不会释放出来的。为了使DNA从细胞核中释放出来，需要向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从
6、而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般510mL的鸡血细胞液加入20mL蒸馏水搅拌5min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用34层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。2溶解细胞核内的DNA在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。3DNA的析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。教材中列举了提取DNA的三种方案，本案例选取方案一。
7、加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.10.2mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。用34层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。用4000r/min转速的离心机，离心15min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。4.DNA的初步纯化如果提取的DNA量不够多且
8、其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色白色。为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯，下面的方案可供参考。将DNA黏稠物再溶解，继续用2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解，以免损失。用34层纱布进行过滤（或离心），滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积分数为95的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。实验一般要求采用预冷的95的乙醇，但对比结果显示，常温下的乙醇溶液也可产生
9、明显效果。从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。此时悬浮于溶液中的DNA丝状物相对含杂质较少，如果出现的丝状物较少，可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分钟。浓缩后的DNA丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。如果DNA丝状物较少，不易吸附在玻璃棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具来帮助DNA分子缠绕。DNA的纯化还有许多其他方法。例如，添加质量分数为25的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随后，加入氯仿异丙醇混合液（
10、体积比为241），通过离心将蛋白质及其他杂质除去,取上清液。可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于酚层中，这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。教师可以根据学校的条件让学生自己设计实验方案，比较实验结果。5DNA的鉴定二苯胺法二苯胺试剂的配制及鉴定DNA的方法参见教科书。需要注意的是，二苯胺试剂在冰箱内可保存6个月，使用前需摇匀。紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯
11、(260nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处)。电泳法此方法适合鉴定纯度较高的DNA。有条件的学校可以参考本专题课题2的实验案例和参考资料部分。案例二以菜花为实验材料进行DNA的粗提取课前准备将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h。提取DNA的具体步骤1.取材称取30g菜花，去梗取花，切碎。2.研磨将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。研磨液的配制方法如下。将10.1gTris（三羟甲基氨基甲烷）加入到50mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76gNaCl、37.2
12、gEDTA、20gSDS。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1000mL。教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一些去污剂，使植物细胞膜破碎，释放DNA。学生可以设置对照实验，比较哪一种方法可以提取到纯度更高的DNA。一般实验室提取高纯度的DNA都采用一种阳离子去污剂十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破碎，同时将DNA与植物中多糖等杂质分开，再用氯仿异丙醇混合液（体积比为241）抽提去除杂质蛋白，得到高纯度的DNA。3.过滤在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000r/min的转速，离心25min，取上清液放入烧杯中)。在4冰箱中
13、放置几分钟后，再取上清液。4.沉淀将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀35min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上。要点4 疑难解答（1）为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。（2）在切碎的洋葱加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl
14、，有利于DNA的溶解。（3）提取洋葱DNA时如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。（4）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。要点5 参考资料1.二苯胺鉴定DNA的化学原理DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。2.研磨液中几种药品的作用Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离。
