1、第2课时基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。科学思维：结合生产实例，说出基因工程的基本操作程序。科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，小组合作探究，尝试提出初步的基因工程构想，完成框架设计。一、基因工程的基本操作程序1目的基因的获取(1)通过化学合成法直接人工合成目的基因对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通过DNA合成仪直接人工合成。全基因或较大基因，使用半合成的方法可以降低成本。(2)通过基因文库获取目的基因基因组文库：是指含有某种生物
2、体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。特点：受体菌群中的不同个体含有该种生物的不同基因拷贝，整个菌群所含有的基因拷贝便可能涵盖了该生物的所有基因。筛选方法：一般采用核酸探针杂交的方法。cDNA文库：从组织细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主，这种包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。特点：含有某种生物的部分基因。2基因表达载体的构建(1)目的：使目的基因进入受体细胞并有效表达，还要能稳定存在且遗传给后代。(2)基因表达载体的构成：目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因等。3将目的基因导入受体细胞(1)将目的基因导入植物细胞方法
3、：主要是农杆菌转化法。原理：双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌向伤口处移动。农杆菌含有Ti质粒，上面有一段转移DNA(TDNA)，能进入受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。过程将目的基因插到农杆菌Ti质粒的TDNA特定区段上转入农杆菌侵染植物细胞整合到受体细胞染色体的DNA上目的基因稳定的遗传和表达(2)将目的基因导入动物细胞主要方法：显微注射法。操作对象：受精卵。其他方法：也可用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞。(3)将目的基因导入微生物细胞方法：感受态细胞法。原理：经过适当处理(Ca2处理)后，细胞质膜对DNA的通透性
4、会发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA。过程CaCl2溶液处理大肠杆菌感受态细胞重组的基因表达载体与感受态细胞混合转化培养筛选含目的基因的微生物4目的基因及其表达产物的检测鉴定(1)从DNA方面进行检测方法：DNA分子杂交法。基因探针：用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。原理：具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下可以按照碱基互补配对原则形成双链。(2)从RNA方面检测受体细胞方法：分子杂交技术。操作：从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交，观察是否出现杂交带。(3)从蛋白质方面进行检测方法：抗原抗体杂交。操作：从待测转基因生物中提取
5、蛋白质，再用相应的抗体进行抗原抗体杂交，观察是否出现杂交带。(4)从个体水平进行鉴定：检测转基因生物是否表现出目的基因控制的性状。二、DNA的粗提取和鉴定1DNA的粗提取2DNA的鉴定判断对错(正确的打“”，错误的打“”)1基因组文库含有某种生物体全部基因片段，cDNA文库只包含某种生物体一部分的基因片段。()答案2一般可采用猪血进行DNA的粗提取。()提示：哺乳动物血液中DNA含量较低，不适宜作为DNA粗提取的材料。3基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。()提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。4将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。()答案5转基因抗虫棉植株抗虫
6、效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。()提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。6可通过DNA分子杂交技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。()答案基因表达载体的构建1基因表达载体的构建过程(1)用同一种限制酶或产生相同末端的限制酶切割含目的基因DNA和质粒，使其产生相同末端。(2)将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示：2限制酶的选择策略甲乙(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst 。不能选择
7、切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma 。为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具有标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。(3)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达，即酶切位点应位于启动子与终止子之间。合作探究：(1)如何区分启动子、终止子、起始密码子和终止密码
8、子？提示：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。(2)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题：限制酶BamHHindEcoRSma 识别序列及切割位点图1图2构建基因表达载体时，能否用Sma 酶切割质粒？为什么？提示：不能；因为Sma 会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？提示：可以防止质粒和目的
9、基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。1在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要 ()DNA连接酶限制性内切核酸酶RNA聚合酶具有标记基因的质粒目的基因四种脱氧核苷酸ABCDA构建重组质粒时，首先要用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。2下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是()A切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用
10、同一种限制酶B抗虫基因表达载体中要有起始密码子C抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的受体细胞D抗虫基因的表达开始于复制原点C切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A项错误；抗虫基因表达载体的构建必须具备启动子和终止子，起始密码子位于mRNA上，B项错误；基因表达载体必须具备标记基因，其作用是检测目的基因是否导入到受体细胞中，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，C项正确；抗虫基因的表达开始于启动子，D项错误。3图甲、图乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是()图甲图乙A用质粒和外源DNA构建
11、重组质粒过程中，不能使用Sma 切割B图甲所示的质粒分子在经Sma 酶切割后含有4个游离的磷酸基团C为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶D用EcoR 、Hind 和BamH中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以A据图分析，质粒中，Sma 的切割位点位于标记基因(抗生素抗性基因)上，在外源DNA分子中，Sma 的切割位点位于目的基因上，因此用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用Sma 切割，A正确；图甲所示的质粒分子只有一个Sma 切割位点，所以在经Sma 酶切割后含有2个游离的磷酸基团，B错误；为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DN
12、A连接酶，C错误；只使用EcoR ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用DNA连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamH 或Hind剪切时，在目的基因上只有一个酶切位点，因此不能切割目的基因，D错误。将目的基因导入受体细胞1目的基因导入受体细胞的方法受体细胞类型方法说明特点植物细胞农杆菌转化法将目的基因插入农杆菌Ti质粒的TDNA上转入农杆菌用农杆菌侵染植物细胞将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上目的基因表达经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花
13、粉管通道进入受体细胞目的基因表达简便、经济，我国科学家独创的一种方法动物细胞显微注射技术将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内获得具有新性状的动物将目的基因导入动物细胞最为有效的方法微生物细胞Ca2处理法(感受态细胞法) 用Ca2处理微生物细胞感受态细胞将基因表达载体与感受态细胞混合在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子简便、经济、有效2农杆菌转化法分析(1)构建携带目的基因的表达载体，需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2处理农杆菌细胞，使其处于感受
14、态，利于重组质粒的导入。(3)由导入目的基因的受体细胞培育到完整的植株要用到植物组织培养技术。合作探究：(1)农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。(2)将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。1下列关于目的基
15、因导入受体细胞的描述，不正确的是()A培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因B显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2处理法D农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法A水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用Ca2处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。2农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA插入植物基因组中。图示
16、为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答：(1)剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程中，需用多种限制酶处理，原因是_，需用_“缝合”双链DNA片段的平末端。(2)目的基因是指_。由过程形成的基因表达载体中，目的基因的上游具有_，它是_识别和结合的部位。(3)过程常用_处理使农杆菌成为感受态细胞。抗生素抗性基因T的作用是_。(4)可通过_技术检测试管苗的染色体DNA上是否插入了目的基因。解析(1)Ti质粒有多种限制酶切割位点，不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列。连接平末端应选用T4 DNA连接酶。(2)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。目的基因的首端具有
17、启动子，以便于RNA聚合酶识别和结合。(3)过程常采用Ca2(CaCl2溶液)处理农杆菌，以增大农杆菌细胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体。(4)检测农杆菌和愈伤组织细胞中是否有目的基因常采用DNA分子杂交技术。答案(1)不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列T4 DNA连接酶(2)编码蛋白质的基因启动子RNA聚合酶(3)Ca2(CaCl2溶液)鉴定和筛选导入了基因表达载体的农杆菌(4)DNA分子杂交课堂小结知 识 网 络 构 建核 心 语 句 背 诵1.基因工程的基本操作程序包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，以及目的基因及其表达产
18、物的检测鉴定等步骤。2.基因组文库是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。从组织细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后，转化宿主，这种包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。3.构建基因表达载体不仅要使目的基因进入受体细胞并有效表达，还要能稳定存在且遗传给后代。基因表达载体除了目的基因外，还应该包括复制原点、启动子、终止子和标记基因等。4.农杆菌Ti质粒上的可转移DNA(TDNA)能进入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上。5.基因导入受体后，能否有效表达需从DNA方面、RNA方面、蛋白质方面、个体水平对生物的特定性状进行筛选和
19、鉴定。6.在酸性条件下，DNA与二苯胺发生反应，溶液呈蓝色。1基因工程主要操作步骤的顺序是()基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因及其表达产物的检测与鉴定目的基因的获取ABCDC基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因及其表达产物的检测和鉴定。2右图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是()A基因表达载体的构建是在生物体外完成的B任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因B由于受
20、体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。3下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是()A的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与B侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到的染色体上C的染色体上若含抗虫基因，则就表现出抗虫性状D只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异D重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，DNA聚合酶一般用于DNA复制过程，A错误；侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的TDNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；如果受体细胞的染色体上含抗虫基因，只能说明抗虫基因成功整合
21、到受体细胞的染色体上，不代表该基因就一定能表达成功，因此不能确定是否表现出抗虫性状，C错误；只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异，D正确。4利用外源基因在受体细胞中表达可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成表达的是()A棉花细胞中检测到载体上的标记基因B山羊乳腺细胞中检测到人的生长激素基因C大肠杆菌中检测到人的胰岛素基因转录出的mRNAD酵母菌细胞中提取到人的干扰素D目的基因完成表达是指目的基因在细胞中合成相应的蛋白质，在酵母菌细胞中提取到人的干扰素，说明导入酵母菌中的人的干扰素基因完成了表达。5下列关于DNA粗提取与鉴定说法错误的是()A柠檬酸钠溶液可防止血液凝固B加蒸馏
22、水是为了让鸡血细胞破裂C在2 molL1 NaCl溶液中DNA会析出D酸性条件下二苯胺与DNA反应呈蓝色C在2 molL1 NaCl溶液中，DNA溶解度较高，不会析出，C错误。6下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图。据图回答：(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在_酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在_的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的_序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的_序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有_、_、4种脱氧核
23、糖核苷三磷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为_。(4)在基因工程中，常用Ca2处理D，其目的是_。解析(1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用Ca2处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。答案(1)逆转录DNA聚合酶氨基酸脱氧核苷酸(2)引物模板(A基因)(3)基因表达载体(4)使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
