1、考点 134 植物组织培养 1植物组织培养的过程(1)菊花组织培养过程 菊花组织 形成愈伤组织 长出丛芽生根 菊花植株。(2)月季的花药培养 第46课时 植物的组织培养技术及 DNA和蛋 白质技术 突破考点提炼方法 脱分化再分化移栽2.菊花茎的组织培养和月季的花药培养比较(1)相同点 理论基础：植物细胞的全能性。基本过程：脱分化再分化试管苗。影响因素：营养、激素、pH、温度、光照等。(2)不同点 菊花茎的组织培养 月季的花药培养 材料 选取 未开花植株的茎上部新萌生的侧枝 通常选择完全未开放的花蕾 光照状况 每日用日光灯照 12 h 开始不需光照，幼小植株形成后才需光照 操作流程 制备培养基外
2、植体消毒接种培养移栽栽培 选材材料消毒接种和培养筛选和诱导移栽栽培选育 结果 正常植株 单倍体植株 提醒 材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝，该部分不仅分生能力强，而且无病毒侵染。月季花药的培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花药进行培养，且在花蕾期，因为此时质地幼嫩，花瓣未开，微生物不易侵入，容易消毒。剥离花药时，尽量不要损伤花药，同时还要彻底去除花丝，防止对实验产生干扰。外植体消毒：所用消毒剂为体积分数为 70%的酒精和质量分数为 0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。培养过程：在初期，菊花的组织培养需光照，月季的花药培养不需光照，而在
3、后期均需光照。3影响植物组织培养的因素(1)材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。(2)营养：常用的培养基是 MS 培养基，其中含有的大量元素是 N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是 Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。(3)激素：在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响实验结果。激素使用的先后顺序及其用量比例对细胞分裂和分化的影响如下表：使用顺序 实验结果 先使用生长素，后使
4、用细胞分裂素 有利于细胞分裂但细胞不分化 先使用细胞分裂素，后使用生长素 细胞既分裂也分化 同时使用 分化频率提高 生长素/细胞分裂素比值与结果 比值高时 促根分化，抑芽形成 比值低时 促芽分化，抑根形成 比值适中 促进愈伤组织生长(4)环境条件：pH、温度、光照等环境条件。如菊花组培所需 pH 为 5.8，温度为 1822，光照条件为每日用日光灯照射 12 小时。1下列关于花药培养过程中注意事项的说法正确的是()A花药培养成功与否与材料选择无关 B花药培养成幼苗后，一定不能分瓶培养 C花药培养的过程中，除了适宜的温度、pH 外，还需一直照光 D一般地讲，材料选在单核期时花药培养成功率较高 对
5、位训练解析 花药培养能否成功受多种因素影响，其中材料的选择与培养基组成是主要的影响因素，所以 A项错；对一般植物来讲，选择单核期花药培养成功率最高，所以 D 项对；在花粉培养成幼小植株前不需照光，C 项错；花药培养成幼小植株后必须分瓶培养，才能诱导愈伤组织分化或幼苗分开，所以 B 项错。答案 D 2下列有关花药离体培养的说法错误的是 ()A对材料的选择最常用的方法是焙花青一铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色 B材料消毒时需先用酒精浸泡，然后用氯化汞或次氯酸钙溶液浸泡，最后用无菌水冲洗 C接种花药后一段时间内不需要光照，但幼小植株形成后需要光照 D若接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体后，
6、要适时转换培养基，以便进一步分化成再生植株 解析 在花药离体培养中需注意各种因素，如 B、C、D 项涉及的措施，对材料选择最常用的方法是醋酸洋红法，只有在某些植物的花粉细胞核不易着色时，才采用焙花青铬矾法。答案 A 3完成下列关于花粉植株产生途径的问题。(1)通过花药培养产生单倍体植株一般有两种途径：一种是花粉通过_阶段发育为植株，另 一 种 是 在 诱 导 培 养 基 上 先 形 成_，再将其诱导分化成植株。这两种途径主要取决于培养基中_的种类及浓度配比。(2)通过上述两种途径得到的单倍体植株具有的特点是_。应如何解决？_。答案(1)胚状体 愈伤组织 激素(2)植株弱小，高度不育 用秋水仙素
7、处理萌发的幼苗 解析 产生单倍体植株的途径有形成胚状体和愈伤组织两种，形成的单倍体植株表现为：植株弱小、高度不育。应用秋水仙素处理幼苗使其染色体加倍，才能表现为正常发育。考点 135 DNA 的粗提取与鉴定 1原理、方法和目的 基本原理 方法 目的 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中的溶解度不同，在 0.14 mol/L的 NaCl 溶液中的溶解度最低 溶于 NaCl溶液中并稀释 NaCl 溶液为 2 mol/L 时，DNA 溶解，而部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于 NaCl 溶液的杂质 当 NaCl 溶 液 稀 释 至 0.14 mol/L 时，DNA 析出
8、，过滤可除去溶于 NaCl 中的部分蛋白质和其他杂质 DNA 不被蛋白酶所水解 加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白质 DNA 不溶于酒精溶液 加入冷却 酒精(95%)DNA 析出，除去溶于酒精的蛋白质 DNA 可被二苯胺染成蓝色 加入二苯胺，并沸水浴 鉴定 DNA 2.实验材料(1)动物 鸡血红细胞、白细胞中都含有细胞核，含大量的 DNA 既经济又易取鸡血细胞液的优点(2)植物：新鲜菜花、蒜黄、菠菜等。3实验步骤及注意事项(1)步骤：提取血细胞核物质(蒸馏水涨破)溶解(2 mol/L 的 NaCl)过滤(除杂质)析出(滴蒸馏水，降 NaCl 浓度至 0.14 mol/L)过滤再溶解(2
9、 mol/L 的 NaCl)过滤进一步提纯(体积分数为 95%的冷却酒精)鉴定。提醒 人和哺乳动物成熟的红细胞中不含细胞核，也没有 DNA，不适于作 DNA 提取的材料，但却是提取血红蛋白的理想材料。友情提示 实验中有多个步骤要用到玻璃棒搅拌，使用时注意玻璃棒不要碰到烧杯底。实验中所用的二苯胺是一种有毒性的试剂，使用时注意不要让药液接触到皮肤或身体的其他部位。(2)鉴定 比较 加入物质 结果 图示 实 验 组 丝状物(DNA)溶液逐渐变蓝 对 照 组 均加入：4 mL 二苯胺试剂 2 mol/L NaCl 溶液 5 mL 不变蓝 (3)注意事项 制备鸡血细胞液时，要在取鸡血的同时加入柠檬酸钠，
10、静置后上层是血清，下层为所需要的血细胞。两次加蒸馏水的目的不同，一是涨破细胞，二是稀释溶液。鉴定 DNA 时需沸水浴加热。二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。对位训练 4DNA 在下列浓度的 NaCl 溶液中溶解度最低的是 ()A2 mol/L B0.015 mol/L C0.14 mol/L D5 mol/L 答案 C 解析 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，当 NaCl 溶液的物质的量浓度为 0.14 mol/L 时，溶解度最低。5DNA 粗提取的实验中，思考回答下列问题。(1)在 DNA 提取中两次用到蒸馏水，其目的分别是_、_。(2)实验中能否以哺乳动物成熟的红
11、细胞为实验材料？为什么？_。答案(1)使血细胞破裂，释放出 DNA 分子 稀释 NaCl 溶液，使 DNA 分子析出(2)不能。哺乳动物成熟的红细胞中不含细胞核无 DNA 分子 考点 136 PCR 扩增技术 1.原理：DNA 复制2.条件：模板、原料、酶、ATP3.场所：体外 PCR 扩增仪4.方向DNA 复制的具体过程涉及 DNA 双链的方向。DNA 的两条链是反向平行的，为了明确地表示 DNA 的方向，通常将 DNA的羟基（-OH）末端称为 3端，两磷酸基团的末端称为 5端。DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从 3端延伸DNA 链，因此,DNA 复制需要引物。当引物与 DNA
12、 母链通过碱基互补配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的 3端开始延伸 DNA 链，DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸。5过程(1)变性：当温度上升到 90以上时，双链DNA 解旋为单链，如下图：(2)复性：温度下降到 50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合，如下图：(3)延伸：温度上升到 72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链，如下图：6.检测 PCR 扩增效果(1)将样品进行 50 倍稀释：取 2 L PCR 反应液，加入 98 L 蒸馏水。(2)以蒸馏水作为空白对照，在波长 260 nm处，将
13、紫外分光光度计的读数调节至零。注意 据测定，1 g/mL 的 DNA 在厚度为 1 cm 比色杯中，OD260为 1 相当于 50 g/mL 的双链 DNA。以此为标准，可以计算出样品中的 DNA 浓度。(4)根据正面的公式计算 DNA 含量。DNA 含量(g/mL)50A260 nm稀释倍数 注意 DNA 在 260 nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用 DNA 的这一特点进行 DNA 含量的测定。（3）延伸：将步骤中的 DNA 稀释液加入到厚度为 1 cm的比色杯中，测定其在 260 nm 处的光吸收值（用 A260 nm表示）。7PCR 技术的应用 PCR 技术模拟细胞内 DNA
14、 的复制过程，实现对某一段 DNA 的扩增。PCR 技术能在几小时内将极微量的DNA 特异性地扩增上百万倍，从而有效地解决了因为样品中 DNA 含量太低而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对 DNA 分子的分析和检测能力，被广泛地应用于基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断、古生物学研究以及刑侦破案、亲子鉴定等诸多方面。拓展提升 PCR 扩增技术和 DNA 复制的比较 DNA 复制 PCR 扩增技术 场所 细胞核内 生物体外 原理 碱基互补配对 碱基互补配对 酶 DNA 聚合酶、解旋酶 耐热的 DNA 聚合酶(Taq 酶)条件 模板、ATP、引物链(RNA)、常温 模板、ATP、引物链(DN
15、A 及 RNA片段)、温度变化(909555607075)原料 四种脱氧核苷酸 四种脱氧核苷酸 特点 形成的是整个 DNA分子，一个细胞周期只复制一次 短时间内形成大量目的基因DNA 片段，呈指数增长2n 对位训练 6标准的 PCR 过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是 ()A95、55、72 B72、50、92 C50、92、72 D80、50、72 解析 当温度上升到 90以上(9095)时，双链 DNA 解旋为单链，称为变性；当温度下降到 50左右(4060)时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合，称为复性；当温度上升到 72(7075)时，溶液中的
16、四种脱氧核苷酸在 TaqDNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链，称为延伸。答案 A 7引物的作用是 ()A打开 DNA 双链 B催化合成 DNA 子链 C使 DNA 聚合酶能够从引物的 3端开始复制 D提供模板 答案 C 8下列不属于 PCR 技术的优点的是()A简单，易于操作 B可以完全无限制扩增 C实用性强，灵敏度高 D快速、高效，并可自动化 解析 PCR 技术要设计引物，因此扩增具有特异性，灵敏度很高。而应用 Taq DNA 聚合酶的 PCR 仪可自动化，操作简单。PCR 技术能在体外迅速扩增DNA 片段，快速高效，往往被误认为可以无限制扩增，其实 PCR 的循
17、环次数一般以 2535 次循环为宜，当反应超过 35 次循环时，PCR 产物也不再增加。答案 B 考点 137 血红蛋白的提取和分离 1蛋白质分离的依据 蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来提取和分离不同种类的蛋白质。2凝胶色谱原理(1)识图析图 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。图 A，相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。图 B，蛋白质混合物上柱；洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝
18、胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外；相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动；相对分子质量不同的分子完全分开；相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。(2)列表比较 蛋白质 比较 相对分子质量大 相对分子质量小 凝胶内部 不能进入 能进入 运动方式 垂直向下 垂直向下和无规则扩散运动 经过路程 较短 较长 洗脱次序 先流出 后流出 提醒 凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果，但直径过大造成洗脱液体积大，样品稀释度大；凝胶色谱柱的高度与分离度有关。3凝胶电泳法原理 凝胶电泳法的原理是不同蛋白质的带电性质、
19、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。如下表：决定运动方向 形成库仑力 形成 阻力 决定运动速率 电荷 性质 电荷量 分子 形状 分子 大小 红细胞洗涤离心去除血清释放血红蛋白蒸馏水涨破分离血红蛋白离心处理4.实验操作流程 粗分离透析(去除小分子杂质)纯化凝胶色谱法进行分离和纯化 纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量 样品的处理提醒 红细胞洗涤过程中，洗涤三次后，上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白；离心时转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离效果。血红蛋白释放过程中，蒸馏水的
20、作用是使红细胞吸水涨破，甲苯的作用主要是溶解细胞膜。为了加快干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需12 h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。滴加样品时，吸管管口要贴着管壁环绕移动，防止破坏凝胶面。对位训练 9使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为图中 ()答案 B 解析 该方法中大分子蛋白质不进入凝胶内部最先流出，小分子进入凝胶内部路径长后流出。10下列关于凝胶色谱法的原理及操作的叙述，不正确的是 ()A是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种 方法 B在洗脱过程
21、中，大分子不能进入凝胶内部而最先 流出，而小分子可以进入凝胶内部流速缓慢，最 后流出 C凝胶内部有很多微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系 D一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来 答案 C 解析 凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法，凝胶多数是由多糖类化合物构成的，其内部有很微细的多孔网状结构，小分子蛋白质可以进入凝胶内部，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，路程较短，移动速度较快，因此在洗脱过程中先分离出来。选用不同的凝胶，其立体网状结构不同，孔隙大小不同，因此可分离的分子
22、大小也不同，故 C 项叙述错误。凝胶一般对分离的物质无吸附作用，所有要分离的物质都应该被洗脱出来，这是凝胶色谱法与一般层析法的不同。DNA 粗提取与鉴定 考纲能力 实验探究能力 考题 1 (2010江苏生物，32)某生物兴趣小组开展 DNA 粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各 2 份，每份 10 g。剪碎后分成两组，一组置于 20、另一组置于20条件下保存 24 h。考题链接DNA 粗提取：第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL 研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。第二步：先向 6 只小烧杯中分别注入 10 mL 滤液，再加入 20
23、 mL 体积分数为 95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。第三步：取 6 支试管，分别加入等量的 2 mol/L NaCl 溶液溶解上述絮状物。DNA 检测：在上述试管中各加入 4 mL 二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表：材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄 20 20 (注：“”越多表示蓝色越深)分析上述实验过程，回答下列问题：（1）该探究性实验课题名称是。（2）第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少。（3）根据实验结果，得出结论并分析。结论 1：与 20相比，相同实验材料在-20条件下保存，DNA
24、 的提取量较多。结论 2:。针对结论 1,请提出合理的解释：。（4）氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和 DNA均不相溶，且对 DNA 影响极小。为了进一步提高粗提取时 DNA的纯度，依据氯仿的特性,在第三步的基础上继续操作的步骤是：，然后用体积分数为 95%的冷酒精溶液使DNA 析出。解析(1)题目给出了多种实验材料，以探究不同保存温度对 DNA 提取量的不同影响，因此该实验名称可为“探究不同实验材料和不同保存温度对 DNA 提取量的影响”。(2)在提取DNA 时，玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，为了有效提取 DNA，防止 DNA 分子断裂。(3)由表格可见，花菜、辣椒、蒜黄三种不同的实验材
25、料在 20时，DNA 提取量表现为蒜黄多于花菜，花菜多于辣椒，在20时结果相同，等质量的不同实验材料，在同一温度下 DNA 提取量不同(或从蒜黄提取的 DNA 量最多)；低温下 DNA 水解酶的活性减弱，导致 DNA 降解速度慢，从而DNA 提取量相对较高。(4)由于氯仿可使蛋白质变性沉淀，而DNA 易溶解与其中，对 DNA 结构无影响，因此可将第三步获得的滤液与等量氯仿混合，静置一段时间，蛋白质变性沉淀，而DNA 溶解于上清液中，从而可吸取上清液，从上清液中提取DNA。答案(1)探究不同材料和不同保存温度对 DNA 提取量的影响(2)DNA 断裂(3)等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下
26、，从蒜黄提取的 DNA 量最多 低温抑制了相关酶的活性，DNA 降解速度慢(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液 蛋白质的提取与分离技术 考纲能力 技术实践应用能力 考题 2 (热点预测题)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2 和部分 CO2 的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。(1)将实验流程补充完整：A 为_，B 为_。凝胶色谱法的基本原理是根据_而达到蛋白质分离的有效方法。(2)洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无 法除去 _；离心速 度过 高和时 间过 长会使_一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_。
27、释放血红蛋白的过程中起作用的是_。(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液(pH 为 7.0)的目的是_。如果红色区带_，说明色谱柱制作成功。答案(1)血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱 相对分子质量的大小(2)杂蛋白(血浆蛋白)血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯(3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的 pH 和体内的一致 均匀一致的移动 体会(1)实验原理：依据蛋白质的各种特性可以将不同种类的蛋白质分离。(2)常用方法 凝胶色谱法：根据相对分子质量的大小分离蛋白质。电泳：利用待分离样品中各种分子带电性质的差导及分子 本身大小、形状的不同产生不同的迁移速度，由此将各种分子分离。(3)蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。返回
