1、 考纲要求1.工具酶的发现和基因工程的诞生加试(a)。2.基因工程的原理和技术加试(b)。3.基因工程的应用加试(a)。4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案加试(c)。考点一基因工程的诞生、操作工具1基因工程的含义(1)概念：把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另外一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。(2)核心：构建重组DNA分子。2基因工程的基本工具思考诊断1已知限制性核酸内切酶EcoR和Sma识别的碱基序列和酶切位点分别为GAATTC和CCCGGG，两种限制性核酸内切酶切割DNA后产生的末端如下。EcoR限制性核酸
2、内切酶和Sma限制性核酸内切酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(相同/不同)，说明限制性核酸内切酶具有专一性。2观察下图所示过程，回答需要的工具酶及相关问题：(1)是限制性核酸内切酶；是DNA连接酶；二者的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制性核酸内切酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。3载体须具备的条件及其作用(连线)4限制性核酸内切酶Mun I和限制性核酸内切酶EcoR的识别序列及切割位点分别是CAATTG和GAATTC。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的
3、质粒是下列中的哪一个？提示由图可知，质粒上无标记基因，不适合作为载体；质粒和的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点。只有质粒上既有标记基因，且Mun的切割点不在标记基因上。题型一基因工程的原理、操作工具1下列关于载体的叙述中，错误的是()A载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子B对某种限制性核酸内切酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点C目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒D载体具有某些标记基因，便于对其进行切割答案D解析载体必须具备的条件有：对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；具有自我复制能力，或能整合到受体细胞的染色体DNA上，随染色体DNA的
4、复制而同步复制；具有一个至多个限制性核酸内切酶切点，以便目的基因可以插入到载体中；带有特殊的标记基因，如抗生素抗性基因，以便于对外源基因是否导入进行检测；载体DNA分子大小适合，以便于提取和进行体外操作。2若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是Bgl (AGATCT)、EcoR (GAATTC)和Sau3A (GATC)。下列分析合理的是()A用EcoR切割目的基因和P1噬菌体载体B用Bgl和EcoR切割目的基因和P1噬菌体载体C用Bgl和Sau3A切割目的基因和P1噬菌体载体D用EcoR和Sau3A切割目的基因和P1噬
5、菌体载体答案D解析解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoR和Sau3A切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。前挂后连几种易混淆酶的比较名称功能应用限制性核酸内切酶特异性地切断DNA链中的磷酸二酯键重组DNA技术和基因诊断DNA连接酶连接DNA片段之间的磷酸二酯键基因工程DNA聚合酶连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键DNA复制RNA聚合酶连接RNA片段与单个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键RNA复制和转录逆转录酶作用于磷酸二酯键以RNA为模板获得DNADNA解旋酶使碱基对之间的氢键断裂DNA复制DNA
6、水解酶使DNA分子所有磷酸二酯键断裂水解DNA题型二基因工程的技术3大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的载体。某限制性核酸内切酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出半乳糖苷酶。当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程。请分析并回答问题。(1)对已获得的目的基因可利用_技术进行扩增。(2)目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复_键。(3)将试管中的物质和大肠杆菌共同置于试管的目的是_；大肠杆菌需事先用Ca
7、2进行处理，目的是_。(4)将试管中的菌液接种于选择培养基上，培养基中加入氨苄青霉素的作用是筛选出_。(5)若观察到培养基上出现_色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是_答案(1)PCR(2)磷酸二酯(3)进行转化使大肠杆菌细胞处于感受态(4)导入pUC18质粒的大肠杆菌(5)白无论大肠杆菌中是否导入重组质粒，均会呈现蓝色菌落考点二基因工程的操作步骤、应用及相关的设计方案1基因工程的操作步骤(1)获得目的基因获取目的基因序列已知：化学合成或PCR扩增；基因序列未知：从基因文库中获取。(2)形成重组DNA分子(基
8、因工程的核心)：通常用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。(3)将重组DNA分子导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。导入方法：用氯化钙处理大肠杆菌，可以增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使重组质粒容易进入。(4)筛选含有目的基因的受体细胞筛选原因：并不是所有的细胞都接纳了重组DNA分子，因此，需筛选含目的基因的受体细胞。筛选方法：用含抗生素的培养基培养受体细胞，选择含重组质粒的受体细胞。(5)目的基因的表达目的基因在宿主细胞中表达，产生人们需要的功能物质。2基因工程的应用(1)基
9、因工程与遗传育种转基因植物培育优点转基因动物(2)基因工程与疾病治疗基因工程药物：如通过大肠杆菌生产胰岛素治疗糖尿病，通过酵母菌生产乙肝疫苗等。基因治疗指的是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。(3)基因工程与生态环境保护利用转基因植物生产聚羟基烷酯，用于合成可降解的新型塑料。改造分解石油的细菌，提高其分解石油的能力。利用转基因微生物吸收环境中的重金属，降解有毒化合物和处理工业废水。思考诊断1基因表达载体的组成及各部分的作用(连线)2据图选择相关的限制性核酸内切酶基因工程中，需使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性核酸内切酶
10、的识别序列和切点是GGATCC；限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GATC。请据图分析：切割目的基因应选择限制性核酸内切酶，切割质粒应选择限制性核酸内切酶。3完成下列填充(1)原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快；多为单细胞；遗传物质相对较少。(2)转化的实质是把目的基因整合到受体细胞基因组中。4补充目的基因检测与鉴定的方法示意图5如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制性核酸内切酶处理目的基因和载体？提示目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制性核酸内切酶处理目的基因和载体，可以获得相同的粘性末端，
11、便于形成重组DNA分子。(2)该实例中为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？提示由于Ti质粒上的TDNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了TDNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。(3)该实例中，检测目的基因是否表达常见的方法是什么？提示用棉叶饲喂棉铃虫。题型一基因工程的操作程序1下面为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是_，二者还具有其他共同点，如_，_(写出两条即可)。(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为_；可使用_把质粒和目的基因连接在一起。(3
12、)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为_，其作用是_。(4)下列常在基因工程中用作载体的是()A苏云金芽孢杆菌抗虫基因B土壤农杆菌环状RNA分子C大肠杆菌的质粒D动物细胞的染色体答案(1)DNA能够自主复制具有遗传特性(2)DNA连接酶(3)标记基因供重组DNA的鉴定和选择(4)C解析(1)a代表的物质是拟核DNA分子，质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外的小型环状DNA分子，两者都能自主复制，并蕴含遗传信息。(2)质粒DNA分子的切割末端能够与目的基因切割末端发生碱基互补配对，可使用DNA连接酶将它们连接在一起。(3)质粒DNA分子上的氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，便于对重组
13、DNA进行鉴定和筛选。(4)作为载体必须具备的条件：在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；有多个限制性核酸内切酶切点；有一定的标记基因，便于筛选。常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。苏云金芽孢杆菌抗虫基因一般作为目的基因；土壤农杆菌环状RNA分子不容易在宿主细胞内保存；动物细胞染色体的主要成分是DNA和蛋白质，不能被限制性核酸内切酶切割，因此不能用作载体。2(2015诸暨中学统考)科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答问题：(1)步骤和中常用的工具酶是_和_。(2)经过和步骤后，有些质粒上的_基因
14、内插入了外源目的基因，形成重组质粒。(3)步骤是_的过程。为了促进该过程，应该用_处理大肠杆菌。(4)步骤是将三角瓶内的大肠杆菌接种到含有四环素的培养基A上培养，目的是筛选_。能在A中生长的大肠杆菌有_种。(5)步骤是用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素和四环素)和C(含四环素)两个培养基的相同位置上。一段时间后，菌落的生长状况如上图所示。含有目的基因的菌落位于(填“B”或“C”)_上，请在图中相应位置上圈出来。答案(1)限制性核酸内切酶DNA连接酶(2)氨苄青霉素抗性(3)将重组质粒导入大肠杆菌氯化钙(4)含四环素抗性基因的大肠杆菌2(5)C如下图所示解析(1)步骤和是将
15、目的基因和质粒用同种限制性核酸内切酶进行切割，得到相同的粘性末端，然后用DNA连接酶将二者连接起来，形成重组质粒。(2)质粒上有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，根据步骤和构建的重组质粒的图像可知，部分质粒的氨苄青霉素抗性基因中插入了目的基因。(3)据题图可知，步骤是将重组质粒导入受体细胞大肠杆菌中的过程；氯化钙处理可增加大肠杆菌细胞壁的通透性，增强其对重组质粒的吸收能力。(4)由于质粒上具有四环素抗性基因，且未被目的基因插入，因此，凡是导入质粒的大肠杆菌均对四环素具有抗性，可以存活，没有导入质粒的不能存活，于是可以筛选出含四环素抗性基因的大肠杆菌；能够在A上生长的大肠杆菌有2种，分别是导入
16、空白质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌。(5)目的基因的插入破坏了氨苄青霉素抗性基因，因此含有目的基因的大肠杆菌无法在含氨苄青霉素的培养基B上存活，但能在C上存活，其所在位置即为B中未长出而C中长出菌落的位置。题型二设计用基因工程技术解决的方案3(2015浙江名校联考)我们日常吃的大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了大米的营养品质。下图为培育转基因水稻的过程示意图，请据图回答：(1)上述过程中，铁结合蛋白基因为_，获取该基因后常用_技术进行扩增。(2)构建重组Ti质粒时，通常要用同种限制性核酸内切酶分别切割_和_。将重组Ti质粒
17、转入农杆菌时，可以用_处理农杆菌，使重组Ti质粒易于导入农杆菌。(3)将含有重组Ti质粒的农杆菌与水稻愈伤组织共同培养时，通过培养基2的筛选培养，可以获得成功导入目的基因的受体细胞，该筛选过程是通过在培养基2中加入_实现的。(4)检测转基因水稻的培育是否成功，需要检测转基因水稻_。答案(1)目的基因PCR(2)含目的基因的DNA片段Ti质粒CaCl2(3)抗生素(4)种子中铁含量解析(1)本题中培育转基因水稻的目的是获得铁含量比普通大米高60%的转基因大米，因此目的基因为铁结合蛋白基因；要大量获得目的基因，一般采用PCR技术进行扩增。(2)构建重组Ti质粒时，要用同种限制性核酸内切酶切割含目的
18、基因的DNA片段和Ti质粒，使二者产生相同的粘性末端，从而便于拼接；CaCl2处理农杆菌可以增大其细胞壁的通透性，从而利于重组Ti质粒导入。(3)重组Ti质粒含有抗生素抗性基因，导入重组Ti质粒的愈伤组织细胞在含有抗生素的培养基上可以存活，而未导入的则无法存活，故可加入抗生素来筛选成功导入的受体细胞。(4)转基因的目的是提高大米中铁含量，因此可通过检测转基因水稻种子中铁的含量来判断转基因水稻的培育是否成功。做模拟练预测1(2015台州中学统考)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大
19、肠杆菌中表达的胰岛素无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达答案D解析目的基因来源于含有人们所需要性状的一切生物，可以是动物、植物，也可以是真菌、细菌等；基因工程中一般要使用同种限制性核酸内切酶进行切割，以获得具有相同粘性末端的目的基因和载体，在DNA连接酶的作用下，将目的基因和载体连接，形成重组DNA分子；人的胰岛素原基因可以在大肠杆菌内表达，但是由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器，合成的胰岛素不具有胰岛素的功能，即没有生物活性；标记基因是为了检测并筛选含重组DNA的细胞，但对于目的基因的表达没有影响。21997年，科学家将动物体内的能够
20、合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据图回答：(1)首先根据胰岛素的氨基酸序列，推测出原胰岛素mRNA上的碱基序列，再根据碱基互补配对原则，用人工方法合成DNA，通过这一过程获得了_基因。(2)图中表示从大肠杆菌的细胞中提取_。(3)图中表示的是_的过程，图中表示的是_。(4)过程表示_。(5)若用两种识别切割序列完全不同的限制性核酸内切酶E和F从基因组DNA上切下目的基因，并将之取代质粒pZHZ1(3.7 kb,1 kb1 000对碱基)上相应的EF区域 (0.2 kb)，操作过程见下图，那么所形成的重组质粒pZHZ2_。A既能被E也能被F切开B能被E但不
21、能被F切开C既不能被E也不能被F切开D能被F但不能被E切开答案(1)目的(2)质粒(3)形成重组DNA分子重组DNA分子(4)将重组DNA分子导入受体细胞(5)A解析(1)人工获取目的基因(胰岛素基因)的方法是：首先根据胰岛素的氨基酸序列，推测出原胰岛素mRNA上的碱基序列，再根据碱基互补配对原则，用人工方法合成目的基因。(2)图中过程为从大肠杆菌的细胞中提取质粒的过程，过程为重组质粒的过程，须用限制性核酸内切酶切割。(3)图中表示的是形成重组DNA分子的过程，图中表示重组DNA(重组质粒)分子。(4)过程表示将重组DNA分子导入受体细胞。(5)若用两种识别切割序列完全不同的限制性核酸内切酶E
22、和F从基因组DNA上切下目的基因，并将之取代质粒pZHZ1(3.7 kb,1 kb1 000对碱基)上相应的EF区域 (0.2 kb)，那么所形成的重组质粒pZHZ2既能被E也能被F切开，故A正确。3(2016浙江4月选考)兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。请回答下列问题：(1)从兔肝细胞中提取mRNA，在_酶的作用下形成互补的DNA，然后以此DNA为模板扩增得到基因E。在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成_，再导入用氯化钙处理的_，侵染矮牵牛叶片。将被侵染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。其中培
23、养过程正确的是_。A叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织B愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽C再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基上生根D愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株(2)取转基因矮牵牛叶片，放入含MS液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于_上，进行液体悬浮培养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量，以判断基因E是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养的作用：一是提供营养；二是_，从而使叶片保持正常的形态。答案(1)逆转录重组DNA分子农杆菌B(2)摇床维持渗透压解析(1)以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录过
24、程，这一过程需要在逆转录酶的催化下进行。获得目的基因后，需在限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用下，将目的基因与载体(Ti质粒)连接形成重组质粒(重组DNA分子)，再将其导入受体细胞。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，先将重组DNA分子导入经氯化钙处理的农杆菌中，再用导入目的基因的农杆菌感染植物细胞，最终实现将目的基因导入植物细胞内的目的。导入目的基因的植物细胞经组织培养过程形成转基因植株。组织培养过程中，叶片在含适宜浓度的生长素和细胞分裂素的培养基上脱分化形成愈伤组织，然后在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽，继而在生长素含量高的培养基上生根，最后形成完整的植株，愈伤组织形成
25、植株的过程中发生细胞的分化。(2)植物组织培养过程中，将愈伤组织等细胞置于摇床上，进行液体悬浮培养，形成多个分散的细胞。培养过程中培养液一方面为植物细胞提供营养，另一面维持一定的渗透压，从而使叶片保持正常的形态。4(2016福州三模)1978年，人类首次利用转基因技术生产人胰岛素，其过程大致如图所示：(1)人胰岛素由A、B两条肽链组成，可根据组成肽链的氨基酸序列，确定编码胰岛素基因的碱基序列，因此可通过_方法获得目的基因。(2)半乳糖苷酶能将无色ONPG分解，产物呈黄色，本生产流程中半乳糖苷酶基因作为_，通过和，完成基因表达载体的构建，写出该过程处理DNA分子所需要的酶：_。(3)表示将重组D
26、NA分子导入受体细胞，用Ca2处理大肠杆菌，目的是使之变为_细胞，利于外源DNA侵染，表示利用化学方法催化二硫键的形成，合成具有生物活性的胰岛素，人体内该过程在胰岛细胞的_中进行。答案(1)人工合成(2)标记基因限制性核酸内切酶和DNA连接酶(3)感受态内质网解析(1)人工合成该目的基因的方法有两种：逆转录法和化学合成法，题中根据人胰岛素由A、B两条肽链的氨基酸序列，确定编码胰岛素基因的碱基序列，再通过人工合成方法获得目的基因属于化学合成法。(2)根据题意分析，胰岛素基因为目的基因，半乳糖苷酶基因为标记基因，通过和过程构建重组DNA分子时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。(3)基因工
27、程中若将重组DNA分子导入大肠杆菌细胞中，则通常采用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，利于外源DNA侵染。胰岛素的化学本质是蛋白质，在核糖体合成后需要内质网的加工，才具有生物活性。课时训练一、选择题1(2015浙江五校联考)通过基因工程生产转基因小鼠，其核心是构建重组DNA分子，所需工具除了载体、限制性核酸内切酶外，还需要()ADNA聚合酶 BDNA连接酶CRNA聚合酶 D解旋酶答案B解析限制性核酸内切酶将目的基因和载体切出相同的粘性末端后，需要DNA连接酶将二者的末端进行拼接。2(2015金华模拟)下列选项中，能正确表示基因工程操作“五步曲”的是()A获得目的基因将重组DNA分
28、子导入受体细胞形成重组DNA分子筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达B目的基因的表达获得目的基因形成重组DNA分子将重组DNA分子导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞C获得目的基因形成重组DNA分子将重组DNA分子导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达D形成重组DNA分子获得目的基因将重组DNA分子导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达答案C解析基因工程的操作中，首先需要获得目的基因，然后将目的基因与载体拼接形成重组DNA分子，再导入受体细胞，由于部分细胞可能未导入成功，因此需要筛选含有目的基因的受体细胞，而导入的目的基因能否表达是基因工程最终是否成功的标志，
29、故最后需要对目的基因的表达产物进行检测，因此正确顺序如C选项。3北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是()A过程获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序B将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白C过程构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达答案B解析将多个抗冻基因编码区相连形成能表达的新基因，合成的蛋白质为新的蛋白质，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋
30、白，故选项B正确；过程是利用逆转录法合成目的基因，由于没有非编码区和编码区中的内含子，所以不能用于比目鱼基因组测序；用作载体的质粒，必须具有标记基因才能便于检测和筛选；应用DNA探针技术，可检测转基因抗冻番茄中目的基因的存在和转录，但不能检测目的基因是否成功表达，故选项A、C、D错误。4天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是()A提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再对其进行扩增B利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因BC利用DNA聚合酶将基因B与质粒
31、连接后导入玫瑰细胞中D将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞答案A解析如果所需要的目的基因的序列是完全未知的，往往就需要构建基因文库，然后从基因文库中获取目的基因，而在基因序列已知的情况下，获取目的基因通常用逆转录法或利用化学方法直接人工合成，因此，A项正确、B项错误；将目的基因与质粒连接的酶是DNA连接酶，而非DNA聚合酶，C项错误；目的基因必须与载体结合后导入受体细胞才能够自我复制和表达，且导入植物细胞常用的载体是农杆菌，而不是大肠杆菌，D项错误。二、非选择题5(2015浙江10月学考暨选考)科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组中，培育具有新花色的矮牵牛。请
32、回答：(1)为了获得大量的目的基因，可将目的基因与含有抗生素抗性基因的质粒DNA连接形成重组DNA，再与经_(A.氯化钙B氯化钠C蔗糖D葡萄糖)处理的大肠杆菌液混合，使重组DNA进入大肠杆菌，用_处理过的玻璃刮刀将稀释后的大肠杆菌液_接种到含有抗生素的固体培养基上，经培养形成_，并进行鉴定和扩大培养。(2)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA后，用_分别切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒，然后用DNA连接酶连接，形成重组DNA分子。(3)取田间矮牵牛的幼嫩叶片，经自来水冲洗后，先用70%_浸泡，再用5%次氯酸钠浸泡，最后用_清洗，作为转基因的受体材料。(4)将消毒后的矮牵牛叶片
33、剪成小片，在含有目的基因的农杆菌溶液中浸泡后，取出并转移至加有适当配比生长调节剂的MS培养基(含蔗糖、琼脂和抗生素，下同)上，使叶小片先经脱分化形成_，再将其转移至另一培养基中诱导形成芽，芽切割后转移到_(A.LB培养基BMS培养基适宜浓度NAACMS培养基适宜浓度BADNAA/BA小于1的MS培养基)上生根，形成完整植株。(5)取出试管苗，在适宜的光照、温度和80%以上的_等条件下进行炼苗。提取叶片组织的DNA，采用PCR技术_目的基因，鉴定目的基因是否成功导入。(6)为判断本研究是否达到预期目的，可比较转基因植株和非转基因植株的_性状。答案(1)A灭菌涂布菌落(2)限制性核酸内切酶(3)酒
34、精无菌水(4)愈伤组织B(5)湿度扩增(6)花色解析(1)氯化钙处理大肠杆菌可增加其细胞壁的通透性，有利于大肠杆菌对重组DNA分子的吸收；为防止杂菌污染，玻璃刮刀等实验器具都应进行相应的灭菌处理，微生物分离接种常用的两种方法是划线分离法和涂布分离法，划线分离法使用的是接种环，而涂布分离法使用的是玻璃刮刀；微生物在固体培养基表面繁殖，会形成肉眼可见的子细胞群体，即菌落。(2)限制性核酸内切酶能够识别DNA分子中特定的核苷酸序列，并在其中的特定位点进行切割，使DNA分子断裂形成粘性末端，用相同的限制性核酸内切酶对含目的基因的DNA和Ti质粒进行切割，可得到相同的末端，然后用DNA连接酶连接，即形成
35、重组DNA分子。(3)利用酒精和次氯酸钠浸泡叶片是为了消除杂菌的干扰，而无菌水是用来洗净表面残留的消毒液，避免影响实验。(4)离体培养的植物组织经适宜条件诱导会脱分化形成愈伤组织，然后在相应条件的诱导下会再分化，生出茎、根，长成试管苗；LB培养基是培养细菌的，MS培养基才是植物组织培养使用的，NAA为生长素类似物，BA为细胞分裂素类似物，当生长素浓度大于细胞分裂素浓度时，促进生根。(5)在适宜的光照、温度和80%以上的湿度等条件下进行炼苗，之后逐步降低湿度，直至达到自然湿度再进行定植，这样有利于提高存活率；PCR技术是一种细胞外DNA复制技术，利用叶片组织的DNA进行PCR扩增，若能够扩增目的
36、基因，则说明成功导入，反之则不成功。(6)转入花色基因是为了让矮牵牛产生新的花色，因此比较转基因植株和非转基因植株的花色，即可知实验是否达到目的。6浙江大学农学院喻景权教授课题组研究发现，一种植物激素油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因(如P450基因和红霉素抗性基因)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答下列问题：(1)获得油菜素内酯合成酶基因的方法有_、_。步骤用PCR技术扩增基因时用到的耐高温酶通常是指_；步
37、骤用到的酶有_。(2)图中导入重组质粒的方法是_，在导入之前应用一定浓度的_处理受体细菌。(3)导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用_制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入_可将含有目的基因的细胞筛选出来。(4)请你为该课题命名：_。答案(1)从cDNA文库中获取从基因组文库中获取人工合成目的基因或PCR扩增技术(任选其中两项即可)TaqDNA聚合酶限制性核酸内切酶和DNA连接酶(2)感受态细胞法氯化钙溶液(3)红霉素抗性基因红霉素(4)探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解解析进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从cDNA文库中获取、从基因组文库中获
38、取、人工合成目的基因或PCR扩增技术等。在构建重组DNA分子的过程中，用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，故用感受态细胞法导入重组DNA分子，导入后，需检测和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检验转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。7(2015湖州八校联考)我国科学家成功克隆了控制水稻理想株型的关键多效基因IPAl。研究发现，IPAl发生突变后，会使水稻穗粒数和千粒重(以克表示一千粒种子的质量)增加，同时茎秆变得粗壮，增强了抗倒伏能力。实验显示，将突变后的IPAl导入常规水稻品种，可以使其产量增加10%以上。下图表示该水稻新品种的简易培育流程，据图回答
39、：(1)步骤是实验所用技术的核心步骤，构建重组质粒时需要用到的工具酶有_。(2)将重组质粒导入土壤农杆菌之前，常用_处理该细菌，以增加该细菌_的通透性。(3)土壤农杆菌的质粒上应该具备_，以便筛选。(4)过程应用的主要生物技术是_，原理是_。在该技术过程中，以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导脱分化，形成_，经再分化培养才能得到水稻新品种植株。(5)从变异类型来分析，该水稻新性状的出现应该属于可遗传变异中的_。答案(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶(2)氯化钙细胞壁(3)标记基因(4)植物组织培养植物细胞的全能性愈伤组织(5)基因重组解析(1)构建重组质粒时需要先用限制性核酸内切酶将目的基因
40、和载体切出相同的粘性末端，然后用DNA连接酶将二者连接。(2)氯化钙处理可增加细菌细胞壁的通透性，让其成为感受态细胞，以利于重组质粒导入。(3)质粒上具有标记基因，目的基因成功导入的受体细胞可表达出标记基因所对应的产物或表现出相应性状，据此可筛选出目的基因成功导入的受体细胞。(4)植物细胞培养成植株的过程中，其技术手段是植物组织培养，原理是植物细胞的全能性；该技术过程中，细胞经脱分化形成愈伤组织，再分化形成植物。8(2016宁波3月选考测试)下图表示利用生物技术获得转基因猪和转基因烟草的过程(图中数字表示过程或技术，字母表示物质或结构)。请回答下列问题：(1)为分离、提纯苏云金芽孢杆菌，先用_
41、培养基进行扩大培养，再用_法进行分离，获得一个个单独的_。(2)研究过程中，采用_技术对目的基因进行扩增，然后将目的基因与质粒等载体结合形成了重组质粒。在重组质粒的构建过程中需要的工具酶有_。(3)图中代表_技术。培养C中的ES细胞时，一般要在培养皿底部制备一层胚胎成纤维细胞，目的是_。(4)若在0.50.6 mol/L的_溶液中用特定的酶处理D，可获得原生质体。若将含有D的培养物放在摇床上，通过_培养可以分散成单细胞，这些单细胞具有_细胞的特征。(5)使用自然生长的烟草茎进行组织培养，需要依次在70%酒精和_溶液中浸泡消毒。各种器皿和培养基等通常用_法灭菌。(6)从经特定免疫处理的猪中提取B
42、淋巴细胞，与_融合，形成杂交细胞，经筛选、克隆化培养后，获得的单一细胞的特征是_。答案(1)LB液体划线分离(涂布分离)菌落(2)PCR(聚合酶链式反应)限制性核酸内切酶和DNA连接酶(3)胚胎体外培养促进ES细胞生长、抑制其分化(4)甘露醇液体悬浮胚性(5)5%次氯酸钠高压蒸汽灭菌(6)骨髓瘤细胞既能产生特异性抗体，又能无限增殖解析(1)LB培养基是培养细菌常用的培养基，液体培养基有利于微生物细胞与营养物质充分接触，利于增殖，故扩大培养应用LB液体培养基；涂布分离法和划线分离法是两种常用的微生物分离方法，前者效果更佳，后者操作相对简便；细菌在固体培养基表面生长增殖会形成细胞集合体，即菌落。(
43、2)PCR是一种人工控制的细胞外DNA复制技术，可用于目的基因的扩增；重组质粒形成时需先用同种限制性核酸内切酶将质粒和含目的基因的DNA进行切割，然后用DNA连接酶将二者拼接。(3)将目的基因导入猪的受体细胞(受精卵)中，需先利用胚胎体外培养技术将转基因受精卵培育成早期胚胎，然后移植到代孕母猪体内孕育，最后分娩产出转基因猪；培养ES细胞时，在培养皿底部制备一层胚胎成纤维细胞(饲养层)，目的是促进ES细胞生长、抑制其分化、保证其可以顺利增殖。(4)甘露醇可维持溶液较高渗透压，防止原生质体吸水胀破；摇床上进行液体悬浮培养可使细胞在液体中分散，避免彼此接触，保持单细胞的存在状态；这些单细胞细胞质丰富
44、、液泡小、细胞核大，具有胚性细胞的特征。(5)为防止微生物的污染，应用70%酒精和5%次氯酸钠溶液对植物组织进行消毒，器皿和培养基经高压蒸汽灭菌处理。(6)经特定免疫处理的B淋巴细胞可产生抗体，骨髓瘤细胞可无限增殖，将两种细胞融合在一起得到杂交瘤细胞，其具有二者优点，既能产生特异性抗体，又能无限增殖。9在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：(1)A过程需要的酶有_。(2)B过程及其结果体现了质粒作为载体必须具备的两个条件是_。(3)C过程的培养基中除含有必要营养物质、
45、琼脂和激素外，还必须加入_。(4)在D过程中，抗虫基因遗传信息的传递过程是_。(5)如果利用DNA分子杂交原理对再生植物进行检测，D过程应该用_作为探针。(6)科学家在进行实验过程中，采用了两种方案：一是将抗虫基因导入离体的棉花叶片细胞进行植物组织培养；请你设想另外一种方案：可以将抗虫基因导入植物的_中，再进行培养，导入成功的标志是_。答案(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶(2)具有标记基因；能在宿主细胞中复制并稳定保存(3)卡那霉素(4)抗虫基因先转录成mRNA，再翻译成蛋白质(5)放射性同位素(或荧光分子)标记的抗虫基因(6)受精卵棉花有抗虫性状的表现解析(1)将目的基因和质粒结合形成重
46、组质粒的过程需要用同一种限制性核酸内切酶，连接时还需要DNA连接酶。(2)作为基因工程的载体，必须具备三个条件：在宿主细胞中能稳定保存并能大量复制；有多个限制性核酸内切酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个；有一定的标记基因，便于筛选。题目中能体现的是。(3)由题可知，我们需要的植株是含有抗虫基因的植株，因此要进行筛选，含有抗虫基因的植株也一定含有抗卡那霉素基因，所以要利用卡那霉素进行筛选。(4)抗虫基因最终要表现出抗虫的性状就必须表达，即通过转录和翻译来实现。(5)目的基因的检测最关键是看受体细胞是否含有目的基因，常用DNA分子杂交技术，以已知目的基因片段作为探针，利用碱基互补配对原则进行检测，可以用放射性同位素(或荧光分子等)标记。(6)将目的基因导入植物细胞，可以选用体细胞或受精卵，最后要进行个体水平检测，即看是否能抗虫。
