1、汉族、哈萨克族湿热痹阻证类风湿关节炎患者 Wnt 信号通路的研究陈慕芝 王璞玉 照日格图【摘 要】目的：检测汉族、哈萨克族湿热痹阻证类风湿关节炎患者 Wnt 信号通路基因，以期发现不同民族类风湿关节炎患者在 Wnt 信号通路上的表现机制是否存在差异，为进一步研究类风湿关节炎的发病机制及临床治疗提供理论依据。方法：运用 PCR Array 技术对 4 例哈萨克族和 4 例汉族湿热痹阻证类风湿关节炎患者的 Wnt 基因进行检测，筛选出表达差异有统计学意义且与类风湿关节炎发病相关的基因，再选取哈萨克族（试验组）与汉族（对照组）湿热痹阻证类风湿关节炎患者，每组 30 例，应用实时荧光定量 PCR 技术
2、对其外周血进行检测，进一步验证所筛选出的 Wnt 基因表达差异。结果：试验组与对照组相比，有 21 个 Wnt 基因表达差异有统计学意义（差异倍数 2，P 0.05）。从中选出FZD9、MMP7、Wnt8A、Wnt1 和 Axin2 基因，用实时荧光定量 PCR 技术进一步验证，发现这5 个基因在试验组中均呈现高表达，2 组间 Wnt8A、Axin2 和 Wnt1 比较，差异有统计学意义（P 2，P 0.05）.Five genes，i.e.FZD9，MMP7，WNT8A，WNT1 and AXIN2 were selected andfurther verified by real-time
3、 fluorescence quantitative PCR.It was found thatthese five genes were highly expressed in the experiment group.There werestatistically significant differences between the two groups in WNT8A，AXIN2and WNT1（P 0.05），具有可比性。本研究经新疆医科大学附属中医医院伦理委员会审批（批号 2016XE0129-1）。1.2 诊断标准1.2.1 西医诊断标准 按照 2010 年美国风湿病学会（AC
4、R）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）制定的 RA 分类标准8。1.2.2 中医证型标准 按照实用中医风湿病学9中湿热痹阻证的诊断标准。1.3 纳入标准 符合上述西医诊断标准和中医证型标准;年龄 1875 岁;患者知情同意。1.4 排除标准 重叠其他风湿病者;重度心肺功能不全者;肝、肾、造血系统等严重原发性疾病者;妊娠或哺乳期妇女;精神病患者。2 方 法2.1 观察项目 临床症状及体征：关节疼痛视觉模拟评分法（VAS）评分、晨僵时间、疾病活动度评分（DAS28）、关节功能分级。实验室检查指标：白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（Hb）、球蛋白（GLB）、白蛋白（A
5、LB）、碱性磷酸酶（ALP）、C-反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）、补体（C3、C4）、红细胞沉降率（ESR）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗 CCP 抗体）、抗角蛋白抗体（AKA）、类风湿因子（RF）、纤维蛋白原、D-二聚体（DD）、凝血酶原时间等。实验室检查项目均由本院检验科完成。2.2 Wnt 信号通路基因检测2.2.1 PCR Array 实验步骤 RNA 的提取、反转录、PCR Array 步骤均按照说明书进行，用核酸蛋白定量仪检测 RNA 浓度、A260/A280，琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。2.2.2 荧光定量实验（RT-PCR）步骤 提取 RNA，进行纯度
6、检测，用质量分数为 1.8%的琼脂糖凝胶电泳，150 V，14 min，电泳完毕后使用凝胶成像仪观察结果，RNA 检测均合格。荧光定量引物信息参照表 1，PCR 热循环参数：95 2 min，95 5 s（40 个循环），60 30 s（40 个循环），60 延伸 30 s。2.3 统计学方法 采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料以表示，符合正态分布采用 t 检验，不符合正态分布采用秩和检验。以 P 0.05 为差异有统计学意义。3 结 果3.1 Wnt 信号通路差异基因结果3.1.1 Wnt 信号通路 PCR Array 结果 仅选取差异有统计学意义（P 0.05）的基因，结
7、果见表 2。3.1.2 RT-PCR 检测结果 应用 RT-PCR 检测 PCR Array 结果中筛选出的 5 个差异基因（FZD9、MMP-7、Wnt8A、Axin2、Wnt1）mRNA 水平分析，结果表明，5 个差异基因都呈现正向倍数变化;其中，2 组间 Wnt8A、Axin2、Wnt1 比较，差异有统计学意義（P 0.05）。见表4。3.3 2 组患者实验室指标比较 2 组患者血常规中 RBC、PLT、Hb 水平比较，差异有统计学意义（P 0.05）;2 组 ESR 水平比较，差异有统计学意义（P 0.05）。见表 5、表 6。4 讨 论本研究发现，2 组患者 RBC、PLT、Hb、E
8、SR水平比较差异有统计学意义（P 0.05）。有研究表明，RA 患者的 RBC 水平降低与炎症、免疫等指标的升高具有相关性，WBC 水平升高可作为 RBC 值降低的危险因素，参与 RA 的发病及病情活动10。PLT 与 RA患者晨僵时间、DAS28 评分、VAS 评分、ESR 等指标均呈显著正相关，PLT 可作为 RA 疾病活动度的灵敏指标之一11。本研究结果提示，哈萨克族与汉族 RA 患者在病情活动性方面存在差异。本研究发现，哈萨克族湿热痹阻证 RA 组与汉族湿热痹阻证 RA 组相比，FZD9、MMP7、Wnt8A、Axin2、Wnt1 这 5 个差异基因均呈现正向倍数变化，其中，Wnt8A
9、、Axin2、Wnt1这 3 个基因差异有统计学意义（P 0.05），且在哈萨克族湿热痹阻证 RA 组中呈高表达。Wnt 信号通路由 Wnt 配体蛋白、细胞膜上相应的受体、胞内信号传导部分和细胞核内的核转录调控因子构成，可分为依赖-连环蛋白（-caternin）的经典 Wnt 信号途径和不依赖-caternin 的非经典 Wnt 信号途径。Wnt 配体蛋白家族可以分为 Wnt1 类和 Wnt5a类，Wnt1 类蛋白包括 Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a、Wnt8b;Wnt5a 类蛋白有 Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b 和 Wnt1112。其中，Wn
10、t1、Wnt8a/b 和 Wnt10a 等能激活經典途径13。研究发现，Wnt 信号通路的激活有助于 RA 中 FLS 的活化，增加的 Wnt1 等可诱导白细胞介素（IL）-1、IL-6 和肿瘤坏死因子-（TNF-）等促炎细胞因子和 MMP3 的产生，导致炎症的发生14。Axin2 是经典 Wnt 信号通路的负调节因子，通过与 APC、CKI、GSK-3结合形成的复合物，使-caternin 磷酸化被降解，从而抑制 Wnt 信号通路。在正常细胞中-catenin 处于较低的水平，以保证关节软骨细胞正常增殖、分化和凋亡15。若-catenin 水平过高，会促进软骨细胞过度增殖分化，引起骨赘的形成
11、;-catenin 水平过低，会抑制软骨细胞的增殖分化，导致骨质疏松的发生，因此，调控 Axin 水平可以间接控制软骨细胞的生长水平16。Wnt 信号通过卷曲蛋白（frizzled，Frz）家族转导，Frizzled 家族包括 10 个跨膜受体和单跨膜共受体启动典型和非典型信号级联17-18。FZD 蛋白家族是含有 7 次跨膜结构域的 Wnt 信号通路受体，负责识别和固定 Wnt 蛋白，并将信息传递到细胞膜内19。研究发现，FZD9 能通过非经典 Wnt 信号途径正向调节骨重塑，在骨折愈合期能正向调节骨修复20。基质金属蛋白酶（MMPs）家族是一类依赖金属锌离子的蛋白水解酶家族，对细胞外基质（
12、ECM）的降解、组织重建以及细胞内多种可溶性因子的调控起重要作用。在正常生理状态下，MMP 与组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）共同调控 ECM 的更新，维持细胞的稳定性。MMP-7 是 Wnt 信号通路的下游靶基因之一，参与细胞增生与凋亡等过程。MMP 广泛存在于结缔组织中，对 ECM 的生理病理作用起调节作用。正常生理情况下，软骨细胞产生的MMP 和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）保持相对平衡，维持了关节软骨基质的合成降解平衡，保证了关节软骨的正常21。当滑膜发生炎症时，MMP 的量或者活性增加，MMP 能直接参与骨与软骨的降解，促进血管的生成，微血管基底膜及间质成分降解，最终导致关节软骨
13、的破坏。非经典 Wnt 信号途径能诱导产生炎性因子，促进骨质破坏，Wnt5 通过活化 FLS 促使RA 患者体内产生更多的炎症趋化因子22。移除关节滑液中的 Wnt7B 时，IL-6、TNF-等炎性因子表达减少，导入 Wnt7B 时，相关炎性因子表达增多，进而加重 RA 病情23。李里等24通过 Wnt 信号通路对 RA 大鼠炎性因子的影响研究发现，炎性因子在 RA 发病中呈高表达，阻断 Wnt 信号通路可显著抑制炎性因子。Wnt 信号通路的异常激活可能导致炎性因子高表达，进而加重 RA 病情。综上所述，汉族、哈萨克族湿热痹阻证 RA 患者外周血 Wnt 信号通路中差异表达基因主要有 FZD9
14、、MMP7、Wnt8A、Axin2、Wnt15 种，其中 Wnt8A、Axin2 和 Wnt1 基因存在显著性差异，且在哈萨克族 RA 组中均呈高表达，考虑这些基因的异常表达可能与哈萨克族湿热痹阻证 RA 患者疾病特点有关。与汉族 RA 患者相比，哈萨克族 RA 患者可能由于 Wnt 基因过表达，更易导致 Wnt 信号通路的异常激活，诱导多种炎症细胞因子的产生，加重了哈萨克族 RA 患者炎症表现，使 MMP 表达量增高，促进血管翳的生成，进而加重关节软骨的破坏，加重患者病情。参考文献1 侯雷，元晓龙，曾苹，等.类风湿关节炎中医证型与病情活动指标的相关性分析J.风湿病与关节炎，2018，7（12
15、）：5-8.2 栗占国，张奉春，鲍春德.类风湿关节炎M.北京：人民卫生出版社，2009：46.3 刘珂，侯毅，郑稼.类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞基因表达的公共数据分析J.中华骨科杂志，2017，37（11）：691-697.4 陈慕芝，巴哈尔古丽，照日格图.新疆哈萨克族类风湿关节炎中医证候特点分析J.现代中西医结合杂志，2015，24（22）：2412-2414.5 熊雪婷，许碧莲.Wnt 信号通路在类风湿性关节炎发病机制中的研究进展J.中国药理学通报，2014，30（1）：13-16.6 刘珂，侯毅，郑稼.类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞基因表达的公共数据分析J.中华骨科杂志，2017，37
16、（11）：691-697.7 KATOH M，KATOH M.Molecular genetics and targeted therapy of WNT-related human diseases（Review）J.Int J Mol Med，2017，40（3）：587-606.8 NEOGI T，ALETAHA D，SILMAN AJ，et al.The 2010 American College ofRheumatology/European league Against Rheumatism classification criteria forrheumatoid arthrit
17、is：Phase 2 methodological reportJ.Arhritis Rheum，2010，62（9）：2582-2591.9 王承德，沈丕安，胡荫奇.实用中医风湿病学M.2 版.北京：人民卫生出版社，2009：1-10.10 孙艳秋，刘健，忻凌，等.2300 例类风湿关节炎患者红细胞计数及其相关参数的数据挖掘研究J.风湿病与关节炎，2018，7（11）：5-9，16.11 王志中，王勇，牟方祥，等.血小板、TNF-及 IL-1与活动期类风湿关节炎的相关性研究J.第三军医大学学报，2011，33（5）：469-472.12 张世蘋，张旭.Wnt 信号通路在肿瘤调控方面的研究进展
18、J.中国药理学通报，2017，33（1）：14-18.13 李思宇，韩秋菊，张建.Wnt 信号通路调控免疫应答的研究进展J.免疫学杂志，2017，33（8）：723-728.14 MAEDA K，TAKAHASHI N，KOBAYASHI Y，et al.Roles of Wnt signals in boneresorption during physiological and pathological statesJ.J Mol Med（Berl），2013，91（1）：15-23.15 SILV?RIO KG，DAVIDSON KC，JAMES RG，et al.Wnt/-catenin
19、 pathwayregulates bone morphogenetic protein（BMP2）-mediated differentiation ofdental folliclecellsJ.J Periodontal Res，2012，47（3）：309-319.16 卢向阳，唐芳，马武开，等.轴蛋白在骨关节炎中的作用机制及研究进展J.风湿病与关节炎，2017，6（1）：64-67.17 KATOH M.WNT signaling pathway and stem cell signaling networkJ.ClinCancer Res，2007，13（14）：4042-4045
20、.18 NIEHRS C.The complex world of WNT receptor signallingJ.Nat Rev MolCell Biol，2012，13（12）：767-779.19 TAURIELLO DV，JORDENS I，KIRCHNER K，et al.Wnt/-catenin signalingrequires interaction of the Dishevelled DEP domain and C terminus with adiscontinuous motif in FrizzledJ.Pro Nat Acad Sci U S A，2012，10
21、9（14）：5154-5155.20 HEILMANN A，SCHINKE T，BINDL R，et al.The Wnt Serpentine ReceptorFrizzled-9 Regulates New Bone Formation in Fracture HealingJ.PLoS One，2013，8（12）：e84232.21 魏國，梁杰.骨性关节炎发病分子机制的研究进展J.实用医学杂志，2015，31（24）：4148-4150.22 LUYTEN FP，TYLZANOWSKI P，LORIES RJ.Wnt signaling andosteoarthritisJ.Bone，2009，44（4）：522-527.23 Nakamura Y，Nawata M，Wakitani S.Expression prolfiles and functionalanalyses of Wnt-related genes in human joint disordersJ.Am J Pathol，2005，167（1）：97-105.24 李里，宫亮，高薇.WNT 信号通路对类风湿关节炎中炎性因子的影响J.现代预防医学，2015，42（11）：2033-2036.收稿日期：2019-11-12;修回日期：2020-01-17
