1、专题十六基因工程（含PCR技术）和细胞工程考向预测1.近五年的全国卷高考试题中对于基因工程的考查频度较高，侧重考查基因工程的工具，操作程序与应用等。植物细胞工程的应用以及动物细胞工程技术中的核移植技术、单克隆抗体的制备也有所考查。2.本专题以非选择题的形式考查。题目常借助简洁的文字材料或流程图、结构图等考查有关基因工程、动物细胞工程的原理、技术手段等，尤为注重对教材中一些关键词的填充及对结论性语句的准确表述等。3.考纲新变化：特别提出了PCR技术，考纲6“动物的细胞培养与体细胞克隆”由I变为II，预计2018年高考可能会涉及此考点。在备考时，可以从以下4个方面入手复习： (1)列表比较法掌握限
2、制酶、DNA连接酶和载体的作用。(2)实例分析法理解基因工程的原理和过程。(3)列表比较法理解两个不同，即植物组织培养和动物细胞培养的不同、植物体细胞杂交与动物细胞融合的不同。(4)图解法分析并掌握单克隆抗体制备过程。知识框架知识与技巧的梳理考点1基因工程1.几种获取目的基因方法的比较2.比较DNA复制和PCR技术3.与DNA有关的酶的归纳与比较4.将目的基因导入受体细胞的方法比较5. DNA的粗提取与鉴定的方法步骤例1.请回答以下有关基因工程的问题：(1)基因工程中切割DNA的工具酶是 。DNA连接酶根据其来源不同，分为_和_。(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核
3、苷酸序列，以便根据这一序列合成_。(3) 是基因工程的核心步骤。启动子是 识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA。(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是 。(5)要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，采用的方法是 技术。【解析】(1)切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶(限制酶)。DNA连接酶根据来源不同分为Ecoli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物。(3)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。(4)目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。(5
4、)检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，需要采用DNA分子杂交技术。【答案】(1)限制性核酸内切酶(限制酶)EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶(顺序可颠倒)(2)引物(引物对)(3)基因表达载体的构建RNA聚合酶(4)农杆菌转化法(5)DNA分子杂交有关基因工程概念及其工具的8个错混点技巧方法 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和运载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。(5)不同DN
5、A分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。(7)基因工程中的运载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的运载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。考点2细胞工程6.植物组织培养的关键点(1)植物组织培养的关键条件：离体、一定的营养物质、激素(生长素、细胞分裂素)等。培养基状态：固体培养基(脱分化培养基、生根培养基及生芽培养基)。体内细胞未表现全能性的原因：基因的表
6、达具有选择性。(2)植物激素的使用生长素/细胞分裂素的比值适中时，促进愈伤组织形成；比值高时，促进根分化、抑制芽形成；比值低时，促进芽分化、抑制根形成。(3)光照的使用脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。7.植物体细胞杂交的关键点(1)酶解法用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。(2)促融剂聚乙二醇。 (3)杂种细胞的形成标志新细胞壁的形成。(4)培养为杂种植株的技术植物组织培养。 (5)培养成功的原理细胞全能性。8.动物细胞培养的特殊条件(1)胰蛋白酶的使用：首先用胰蛋白酶处理动物的器官或组织，以制备单细胞悬液；培养过程中发生接触抑制时，同样要用胰蛋白酶使细胞分散开
7、。(2)避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。(3)特殊的营养条件液体培养基。加入动物血清、血浆等。通入氧气以满足代谢的需要。通入二氧化碳以维持培养液的pH。9.克隆动物的技术手段动物细胞培养、核移植、早期胚胎培养和胚胎移植。10.突破体细胞克隆(1)在细胞核移植技术中，注入去核卵母细胞中的不是供体细胞的细胞核，而是整个细胞，同时伴随有两细胞融合现象，这体现了细胞膜的结构特点具有一定的流动性。(2)该技术中形成的重组细胞最终发育成一个新个体，体现了动物细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。(3)克隆属于无性繁殖，产生的新个体的绝大多数性状与供核亲本相同
8、。(4)利用核移植技术获得的动物与供核动物性状不完全相同：克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞的细胞核，但其细胞质中的DNA主要来自去核的卵母细胞。性状是基因型与环境共同作用的结果，供核动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不完全相同，其性状可能和供核动物也不完全相同。克隆动物在个体发育过程中有可能发生基因突变，产生供核动物没有的性状。例2.单克隆抗体的制备过程如图所示：(1)植物体细胞杂交和单克隆抗体制备，都应用了细胞融合技术，电激和聚乙二醇都可以诱导相应的细胞融合，在诱导动物细胞融合时，还可以用 。细胞融合的原理是_。(2)融合后的细胞，仅仅由两个细胞互相融合的类型有_种，其中符合要求的细胞是
9、 ，其特点为_。(3)向动物体内反复注射某种抗原，并从动物血清中分离出抗体，这种抗体与单克隆抗体相比，存在的缺点是 。由单克隆抗体技术研制成的“生物导弹”由两部分构成，其中一部分被称为“瞄准装置”，它作用的原理是 ，其特点为_。【解析】(1)电激和聚乙二醇都可以诱导相应的细胞融合，在诱导动物细胞融合时，还可以用灭活的病毒诱导。细胞融合的原理是细胞膜的流动性。(2)融合后的细胞，仅仅由两个细胞互相融合的类型有3种，其中符合要求的细胞是杂交瘤细胞，其特点为既能无限增殖，又能产生特定的抗体。(3)向动物体内反复注射某种抗原，并从动物血清中分离出抗体，这种抗体与单克隆抗体相比，存在的缺点是产量低、纯度
10、低、特异性差。由单克隆抗体技术研制成的“生物导弹”由两部分构成，其中一部分被称为“瞄准装置”，它作用的原理是抗原与抗体杂交，其特点为特异性强。【答案】(1)灭活的病毒诱导细胞膜的流动性(2)3杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生特定的抗体(3)产量低、纯度低、特异性差抗原与抗体杂交特异性强单克隆抗体制备过程中两次筛选分析技巧方法第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞(A为B细胞，B为骨髓瘤细胞，不需要A、B、AA、BB型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。（45分钟）限时训练经典常规题1.(2017江苏卷)金属硫蛋白(MT)是
11、一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR 扩增过程示意图如下，请回答下列问题：(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过_获得_用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1 和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ，而造成引物自连。(3)图中步骤1代表_，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物
12、长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_。(填序号：升高退火温度降低退火温度重新设计引物)。【解题思路】(1)由mRNA获得目的基因片段需通过逆转录获得的片段为cDNA。(2)为方便构建重组质粒，宜在引物中增加适当的限制酶位点以便使复制出的目的基因两端含限制酶切点；设计引物时，需避免引物之间碱基互补配对，以防引物间自连。(3)图中步骤1为高温下实现DNA变性解链。(4)PCR扩增时，若退火温度过高会破坏引物与模板间的碱基互补配对，DNA片段中G与C间可形成三个氢键，GC比例越高时DNA分子越稳定，其退火温度应
13、越高。(5)若PCR反应得不到任何扩增产物，则可通过降低退火温度及重新设计引物等措施，以便使引物与模板结合，从而进行后序扩增过程。【答案】(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高 (5)2.(2017海南卷)甲、乙两名同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。回答下列问题：(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是_。(2)甲、乙同学在诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到_。若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件
14、是_(填“具有完整的细胞核”“具有叶绿体”或“已转入抗性基因”)。(3)图中A、B、C所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是 。A中的愈伤组织是叶肉细胞经_形成的。(4)若该种植物是一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法繁殖，在培养时，_(填“能”或“不能”)采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是 。【解题思路】(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是绿色叶片和白色花瓣的细胞具有全能性，在一定条件下能发育成完整的植株。(2)在
15、诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到葡萄糖、果糖；若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是具有完整的细胞核。(3)培养基中两种激素是细胞分裂素、生长素；愈伤组织是叶肉细胞经脱分化形成的。(4)要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法繁殖，在培养时，不能采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同。用花粉粒进行组织培养得到花卉基因型不同于原植株。【答案】(1)绿色叶片和白色花瓣的细胞具有全能性，在一定条件下能发育成完整的植株(2)葡萄糖、果糖具有完整
16、的细胞核(3)细胞分裂素、生长素脱分化(4)不能对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同。用花粉粒进行组织培养得到花卉基因型不同于原植株高频易错题 3.(2017河北联盟质检)在基因工程中，将目的基因导入受体细胞是一个重要的环节：(1)如果是将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 。其次还有_和 等。(2)如果是将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 。此方法的受体细胞多是_。(3)原核生物作为受体细胞的优点是 ，最常用的原核细胞是 ，其转化方法是：先用_处理细胞，使其成为_ _，再将_溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的_下促进受体细胞吸收DNA分子
17、，完成转化过程。(4)重组DNA导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是 。【解题思路】(1)如果是将目的基因导入植物细胞，方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，其中采用最多的方法是农杆菌转化法。(2)如果是将目的基因导入动物细胞，最常用的方法是显微注射法，受体细胞一般是受精卵。(3)基因工程中细菌等原核生物具有的优点是：繁殖速度快、遗传物质相对较少、多为单细胞、且操作简便。最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用CaCl2溶液处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进受体细胞吸收DNA分子，完成转化过程。(
18、4)基因表达载体上的抗性基因可用于筛选出含有基因表达载体的受体细胞，因此重组DNA导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达，受体细胞是否产生相应的性状。【答案】(1)农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法(2)显微注射技术受精卵(3)繁殖速度快、多为单细胞、遗传物质相对较少大肠杆菌Ca2感受态细胞重组表达载体DNA分子温度(4)标记基因是否表达4. (2017九江七校联考)根据植物体细胞杂交技术流程图，回答相关问题。(1)运用传统有性杂交(即用番茄、马铃薯杂交)，自然状态下不能得到杂种植株，原因是_。(2)在利用杂种细胞培育杂种植株的过程中，依据的原理是_，其中过程称为_
19、，植物体细胞融合完成的标志是_。(3)已知番茄、马铃薯分别为四倍体、二倍体，则“番茄马铃薯”属于_倍体植株。(4)已知柴油树种子含有的柴油是植物细胞的代谢产物，可用植物组织培养来实现柴油的工业化生产。若利用此技术，将柴油树细胞培养到_阶段即可(填字母编号)。(5)若培育抗虫棉，将抗虫基因通过适当的途径导入棉花受精卵，然后进行组织培养，该过程相当于_过程(填字母编号)。(6)人工种子是由发育到_过程(填字母编号)的结构包裹上人工种皮制备的。【解题思路】(1)番茄和马铃薯属于两个物种，存在生殖隔离，不能通过有性杂交产生后代。(2)在利用杂种细胞培育杂种植株的过程中，依据的原理是细胞的全能性，其中过
20、程称为原生质体融合，植物体细胞融合完成的标志是产生新的细胞壁。(3)由于番茄、马铃薯分别为四倍体、二倍体，因此“番茄马铃薯”属于异源六倍体。(4)柴油是植物细胞的代谢产物，将柴油树细胞培养到愈伤组织阶段即可提取，愈伤组织阶段为图中的e阶段。(5)若培育抗虫棉，将抗虫基因通过适当的途径导入棉花受精卵，然后进行组织培养，包括脱分化和再分化两个阶段，即图中的。(6)人工种子是用胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等包裹上人工种皮制成的。【答案】(1)不同种的植物存在生殖隔离(2)细胞的全能性 原生质体融合 产生新的细胞壁(3)六 (4)e (5) (6)f精准预测题5. (2018西安长安一中)科研人员采用转
21、基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以便通过乳腺生物反应器生产人凝血因子IX医用蛋白，其技术路线如图所示：(1)研究人员在过程中，利用PCR技术扩增人凝血因子IX基因时，除了酶、引物、模板以外，还需要加入_ _作为合成DNA的原料；PCR过程中需要不断调整反应体系的温度，一般情况下，至少需要_个不同的反应温度。(2)通过步骤获得的A，除了人凝血因子IX基因外，还含有_（至少三个）等结构。(3)过程指_，重组胚胎可以与普通代孕母羊的子宫建立正常的生理和组织联系，但是出生后的转基因绵羊依然具有生产人凝血因子IX医用蛋白的能力，原因是_。(4)理论上，可以通过少量整合有目的基因的成纤维细胞，克隆出大量
22、转基因绵羊，请对这一问题做出两个合理的解释： ； 。【解题思路】本题综合考查学生对基因工程的知识的识记和理解能力。解答本题需熟记并理解基因工程的基本操作程序并形成清晰的知识网络。在此基础上，结合问题情境，从题意和题图中提取有效信息并与胚胎工程、核移植等知识建立联系，进行相关问题的解答。(1)利用PCR技术扩增人凝血因子IX基因时，除了酶、引物、模板以外，还需要加入dATP、dGTP、dCTP、dTTP（或dNTPs）。PCR过程中需要不断调整反应体系的温度，一般情况下，至少需要3个不同的反应温度，即温度上升到90至95时双链DNA解聚为单链，温度降到55至60时两种引物通过碱基互补配对与两条D
23、NA单链结合，温度上升到70至75时进行子链的延伸。(2)通过步骤获得的A为基因表达载体，该基因表达载体除了人凝血因子IX基因（目的基因）外，还含有启动子、终止子、复制原点、标记基因。(3)过程指胚胎移植。由于移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中不受任何影响，所以出生后的转基因绵羊依然具有生产人凝血因子IX医用蛋白的能力。(4)因整合有目的基因的成纤维细胞可以进行传代培养，加之转基因绵羊的体细胞可以作为供体细胞，克隆更多转基因绵羊，所以理论上，可以通过少量整合有目的基因的成纤维细胞，克隆出大量转基因绵羊。【答案】(1)dATP、dGTP、dCTP、dTTP（或dNTPs） 3 (2)启动
24、子、终止子、复制原点、标记基因 (3)胚胎移植 移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中不受任何影响 (4)整合有目的基因的成纤维细胞可以进行传代培养 转基因绵羊的体细胞可以作为供体细胞，克隆更多转基因绵羊6. (2018辽宁凌源实验中学)下图为单克隆抗体生产的流程图。回答下列问题:(1)图示中需要给小鼠注射特定的_，目的是_。(2)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成_种类型的丙细胞，需要将融合细胞用 培养基进行筛选，再进行_，以得到足够数量的符合要求的_ (填“单”、“双”或“多”)核杂交瘤细胞。(3)与一般的血清抗体相比，单克隆抗体的优点是 。紫杉醇能阻止肿瘤细胞有丝分裂，促进其凋亡，
25、用单克隆抗体A1或A2与紫杉醇结合研制而成的“生物导弹”，对于晚期低分化型的甲状腺瘤患者有较好的疗效，其中起导向作用的是_。【解题思路】本题以“单克隆抗体生产的流程图”为情境，综合考查学生对生产单克隆抗体相关知识的识记和理解能力。解答本题需熟记并理解生产单克隆抗体的过程、单克隆抗体的优点及其应用的基础知识并形成清晰的知识网络。在此基础上，结合问题情境，从题图中提取有效信息进行相关问题的解答。(1)在生产单克隆抗体时，需要给小鼠注射特定的抗原，其目的是使小鼠体内产生相应的B淋巴细胞。(2)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成甲与甲融合、乙与乙融合、甲与乙融合的3种类型的丙细胞，需要将融合细胞用选择性培养基进行筛选，将甲与乙融合的杂交瘤细胞筛选出来，再进行克隆化培养和抗体检测，以得到足够数量的符合要求的单核杂交瘤细胞。(3)与一般的血清抗体相比，单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高、并可大量制备。用单克隆抗体A1或A2与紫杉醇结合研制而成的“生物导弹”，对于晚期低分化型的甲状腺瘤患者有较好的疗效，其中起导向作用的是单克隆抗体A1或A2。【答案】(1)抗原 使小鼠体内产生相应的B淋巴细胞 (2)3 选择性 克隆化培养和抗体检测 单 (3)特异性强、灵敏度高、并可大量制备 单克隆抗体A1或A2
