1、患病南美白对虾病原的确定与药物治疗效果唐红霞 郝爽 张振国 黄俊岭 邵鹏 罗璋 冯守明摘要：2019 年 7 月，天津市某南美白对虾（Litopenaeus vannamei）养殖池塘发生病害，其主要症状为体色微红，空肠空胃，肝胰腺萎缩。为分析病因，通过寄生虫和病毒检测、病原菌分离鉴定和药物敏感性测定等方法对患病南美白对虾及病原进行了研究。结果表明：从患病南美白对虾鳃丝中未发现大量寄生虫;传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒检测结果为阴性，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和肝肠胞虫检测结果为阳性;肝胰腺中存在大量细菌，对优势菌落进行纯化并
2、命名为 DX-201901，根据生理生化特征和法国梅里埃细菌全自动鉴定系统将其鉴定为副溶血弧菌;菌株DX-201901 对盐酸四环素、盐酸土霉素、硫酸链霉素和氟苯尼考等 4 种药物较为敏感，选择氟苯尼考为治疗药物，按 25.0 mg/kg 虾体重进行拌料投喂，每天投喂 1 次，连续投喂 5 d，取得了较好的治疗效果。关键词：南美白对虾（Litopenaeus vannamei）;副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）;药物敏感性;治疗南美白对虾（Litopenaeus vannamei）因适应能力强、生长速度快、营养价值高等优点而被广泛养殖，是当今世界养殖产量最高的三大虾类
3、品种之一。然而，近年来南美白对虾病害的频频发生已经严重阻碍了该产业的发展。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、欧文氏弧菌（Vibrio owensii）、坎贝氏弧菌（Vibrio campbellii）等细菌性病原1-4;白斑病毒、桃拉病毒、偷死野田村病毒等病毒性病原5-6;以及寄生虫病原，例如肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei）等相继被报道7。疾病已成为阻碍南美白对虾产业发展的最主要因素之一8。与所有甲壳动物类似，对虾没有获得性免疫系统，其防御病原感染的途径主要依靠先天性免疫。因此，目前尚未有
4、针对南美白对虾的疫苗可以使用，这进一步增加了南美白对虾对化学药物的依赖性。2019 年 7 月中旬，天津市武清区某南美白对虾養殖池塘发生疾病，为了尽快进行病因分析，以便采取合理措施控制疾病的蔓延，笔者对病原进行了分离，并对分离纯化的疑似病原开展了药物敏感性试验，利用筛选的药物进行治疗，取得了较好的效果。1 材料与方法1.1 南美白对虾的发病情况在巡塘过程中，将设置在池塘中的移动料台拎出水面进行观察，发现有部分虾存在异常，典型症状为虾体和须微红，空肠空胃，肝胰腺萎缩，活力差，随机统计 100 尾虾，具有患病症状虾的比例为 28%。1.2 病原菌的分离和寄生虫观察用 75%酒精棉球反复擦拭患病南美
5、白对虾体表后，在无菌操作台中用接种环从虾的肝胰腺取少量样品划线接种于营养琼脂（LB）平板和硫柠胆蔗琼脂（TCBS）平板，28 培育 24 h 后，选优势菌落进行纯化获得纯培养 DX-201901。同时，取患病南美白对虾的鳃丝、附肢和肝胰腺在显微镜下进行寄生虫检查。1.3 南美白对虾病原的检测随机取 9 尾具有典型症状的患病虾，取肝胰腺混合后均分为二份，分别使用DNA 和 RNA 提取试剂盒按照说明书提取 DNA 和 RNA，并将 RNA 反转为 cDNA 作为模板进行病原检测。分别用 PCR 和套式 PCR 的方法对副溶血弧菌、传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑病毒、肝肠胞虫、虹彩病毒和偷死野
6、田村病毒等 6种病原进行检测，引物序列见表 1。PCR 反应体系为：DNA 或 cDNA 模板 1.0L，2Mix 25 L，上下游引物各 0.5 L（10 mol/L），补齐双蒸水至50 L。PCR 的反应条件为：94 预变性 5 min 后进行如下循环，95 变性30 s，55 退火 30 s，72 延伸 60 s，35 个循环，最后 72 延伸 10min，4 保存。1.4 病原菌的鉴定1.4.1 形态学观察将菌株 DX-201901 分别划线接种于 LB 平板和 TCBS 平板，28 培养 24 h 后，肉眼观察其菌落形态，并挑取少量菌苔进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察染色特性和菌体
7、形态。1.4.2 全自动细菌鉴定仪鉴定利用梅里埃 VITEK 2 Compact 系统，按 GN 试剂卡片说明书操作。1.5 药物敏感性测定1.5.1 待测细菌的准备将 DX-201901 菌株接种在 LB 培养液中，28 150r/min 过夜培养后，6 000 g，10 min 离心收集菌体，无菌 0.75%生理盐水洗涤一次后，将菌液浓度调整至 1107 CFU/mL，备用。1.5.2 供试药物的选择选择硫酸新霉素、诺氟杀星、硫酸链霉素、盐酸土霉素、硫酸庆大霉素、盐酸四环素、氨苄青霉素、恩诺杀星、硫酸卡那霉素、氟苯尼考等 10 种药物进行药敏试验。1.5.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定参
8、照陈昌福等9的方法进行。各种药物用适宜介质溶解后，采用 2 倍稀释法用 0.75%无菌生理盐水将各种药物依次稀释至 1 000.00.25 g/mL 等 13 个浓度。然后再用 LB 培养液将各浓度的药物稀释 10 倍，最终，各种药物的浓度为 100.00.025 g/mL 等 13 种。将 100.0L 1107 CFU/mL 的 DX-201901 菌液加入到含不同浓度药物的 LB 培养基中，28 150 r/min 培养 24 h 后，肉眼观察证实无菌生长的最低药物浓度，即为该药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations，MIC）。1.6 药物治
9、疗试验将氟苯尼考按 25.0 mg/kg 南美白对虾体重的使用量，与粘合剂混匀后均匀拌在饲料中制备成药物饵料进行投喂，每天投喂 1 次，连续投喂 5 d。2 结果2.1 病原菌的分离取具典型症状的南美白对虾肝胰腺划线接种于 LB 和 TCBS 平板，都长出大量形态单一的菌落，从 TCBS 平板中取优势菌落进一步纯化，分离得到细菌 1 株，命名为 DX-201901。该菌株在 LB 平板上 28 培养 24 h 后，形成圆形、湿润、光滑、边缘整齐中间隆起的淡黄色菌落，在 TCBS 上形成形态类似的蓝绿色菌落。2.2 病原菌的鉴定通过革兰氏染色，发现菌株 DX-201901 为革兰阴性短杆菌，无芽
10、胞，呈弧状。利用法国梅里埃公司的全自动微生物鉴定系统鉴定的结果为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），可信度为 96%，鉴定评语为极好的鉴定。具体生化反应见表 2。2.3 南美白对虾的病原检测利用显微镜，除在鳃丝中发现少数累枝虫外，未观察到其他寄生虫。利用 PCR方法对具有典型症状的南美白对虾进行 6 种病原的检测，结果显示：副溶血弧菌和肝肠胞虫为阳性，传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒为阴性（图 2）。10 种抗菌药物对菌株 DX-201901 的 MIC 测定结果如表 3 所示。盐酸土霉素、盐酸四环素、硫酸链霉素和氟苯尼考具有较好的抑菌
11、效果，最小抑菌浓度分别为3.12、1.56、1.56 和 0.78 g/mL，其他各种药物的最小抑菌浓度都12.5g/mL。2.5 野外治疗效果根据药物敏感性试验结果，采用最小抑菌浓度值较低的氟苯尼考对患病南美白对虾进行治疗，在投喂 3 d 后，料台中具有典型症状的虾数量下降，随机统计100 尾虾，具有症状的南美白对虾比例为 12%，连续用药 5 d 后，料台中没有发现具有典型症状的南美白对虾，说明氟苯尼考对该疾病具有较好的治疗效果。3 讨论据统计，2018 年因病害给我国南美白对虾养殖造成的直接经济损失为 117.8 亿元10。为了对疾病进行预防，通常使用微生态制剂、藻类、免疫增强剂等产品改
12、善养殖水体环境和调节南美白对虾的免疫能力，这些措施在南美白对虾养殖中发挥了重要作用。然而，当疾病发生以后，这些措施往往效果不佳，疾病治疗仍需以使用药物为主。按照病原分类，南美白对虾的疾病可分为寄生虫性、病毒性和细菌性疾病。目前，南美白对虾的寄生虫性病原主要是纤毛虫类和肝肠胞虫，本试验中通过显微镜观察未发现大量的纤毛虫，但检测到肝肠孢虫阳性。据报道，肝肠孢虫主要是影响南美白对虾生长，感染后表现为生长速度缓慢，不产生体色发红空肠空胃等发病特征。根据前期的监测结果，传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒等四种病毒是天津地区南美白对虾的常见病毒性病原，但本试验中检测结果均为阴
13、性，因此初步排除了寄生虫和病毒性疾病的可能。检测结果显示副溶血弧菌阳性，且从南美白对虾肝胰腺进行病原的分离，发现 TCBS 平板上生长出大量的蓝绿色菌落，经鉴定为副溶血弧菌。这暗示着副溶血弧菌可能是引起此次病害的病原。根据柯赫氏法则，如果需要对分离的疑似病原进行确认，应该利用分离株对同类动物进行回归感染试验，该项操作通常需要 715 d。南美白对虾具有残食的特点，发病个体由于行动迟缓容易被健康个体殘食，从而导致了病害传播速度非常快，这对生产实际中如何快速判断病原提出了更高的要求，所以本试验没开展回感试验;但是，分离到的疑似病原经鉴定为副溶血弧菌，该菌是南美白对虾的常见病原，引起南美白对虾的急性
14、肝胰腺坏死病，主要症状为肝胰腺萎缩，体色发红1，与本次发病观察到的症状一致。据此，我们判断引起此次病害的病原为副溶血弧菌的可能性较大。为了较好地选择有效药物对水产动物细菌性疾病进行治疗，需要对病原菌进行药物敏感性测定。较常见的测定方法有两种，一种为纸片法，即将带有一定浓度药物的纸片粘贴于涂布了待测菌液的平板上，培养一定时间后通过测定抑菌圈的大小来判断敏感程度，该方法操作方便、简单，但通常用于定性试验。另一种方法为本试验中使用的最小抑菌浓度（MIC）法，该方法能准确计算出药物对病原菌的 MIC 值，因此在生产实际中较为实用。实验结果表明，盐酸四环素、盐酸土霉素、硫酸链霉素和氟苯尼考对菌株 DX-
15、201901 有较好的抑菌效果，而硫酸新霉素、恩诺沙星、硫酸庆大霉素、氨苄青霉素、硫酸卡那霉素和诺氟沙星的抑菌效果比较差。我们选择了抑菌效果较好的氟苯尼考对南美白对虾进行治疗，连续用药 5 d 以后，料台中已经找不到具有典型症状的南美白对虾，说明氟苯尼考对该疾病具有较好的治疗效果。南美白对虾由于养殖利润高而受到养殖者的青睐，据统计，天津市 50%以上的池塘都在开展南美白对虾养殖，但病害的发生也非常普遍，很多养殖者也因此失去信心。而本试验的研究表明，在准确判断病原后，筛选合适的药物进行治疗，能起到较好的效果。此外，由于南美白对虾病害不易被发现，且传播速度快，因此养殖过程中一定要细观察，多巡塘，争
16、取早发现早治疗，减少经济损失。参考文献：1 Lee C T，Chen I，Yang Y，et al.The opportunistic marine pathogenVibrio parahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid thatexpresses a deadly toxinJ.PNATL ACAD SCI USA，2015，112（34）：10798-10803.2 Kondo H，Van P T，Dang L T，et al.Draft genome sequenceof non-Vibrio parahaemoly
17、ticus acute hepatopancreatic necrosis diseasestrainKC13.17.5，isolated from diseased shrimp inVietnamJ.Genome Announc，2015，3（5）：e00978-15.3 Liu L Y，Xiao J Z，Xia X M，et al.Draft genome sequence ofVibrio owensii strain SH-14，which causes shrimp acutehepatopancreatic necrosis diseaseJ.Genome Announc，201
18、5，3（6）：e01395-15.4 Dong X，Wang H L，Xie G S，et al.An isolate Vibrio campbelliicarrying the pir VP gene causes acute hepatopancreatic necrosisdiseaseJ.Emerg Microbes Infect，2017，6（1）：e2.5 Walker P J，Mohan CV.Viral disease emergence in shrimpaquaculture：origins，impact and the effectiveness of health ma
19、nagementstrategiesJ.Rev.Aquac，2009，2：125-154.6 Zhang Q L，Liu Q，Liu S，et al.A new nodavirus is associatedwith covert mortality disease of shrimpJ.J Gen Virol，2014，95：2700-2709.7 Tangprasittipap A，Srisala J，Chouwdee S，et al.ThemicrosporidianEnterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces s
20、yndromein Whiteleg shrimp Penaeus（Litopenaeus）vannameiJ.BMC Vet Res，2013，9（1）：1-10.8 Hsieh S L，Wu C C，Liu C H，et al.Effects of the water extractof Gynura bicolor（Roxb.&Willd.）DC on physiological and immuneresponses to Vibrio alginolyticus infection in white shrimp（Litopenaeus vannamei）J.Fish Shellfi
21、sh Immunol，2013，35：18-25.9 陳昌福，刘远高，何广文，等.克氏原螯虾暴发病细菌性病原的研究J.华中农业大学学报，2009，28（2）：193-197.10 农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会.我国水生动物重要疫病状况报告M.北京：中国农业出版社，2019：24.（收稿日期：2020-02-20）基金项目：天津市水产研究所创新团队项目（scyjs201904）;天津市科技计划项目（18ZXBFNC00040）;天津市水产产业技术体系创新团队项目（ITTFR201708）。作者简介：唐红霞（1993-），女，硕士研究生，研究方向：水产养殖动物病害。E-mail：emailprotected。通信作者：冯守明（1965-），男，研究员，研究方向：水产动物病害。E-mail：emailprotected。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2020.04.008
