1、第35讲微生物的培养与应用A级基础练一、选择题1下列有关微生物培养的叙述，错误的是()A测定土壤样品中的细菌数目，常用稀释涂布平板法进行菌落计数B在对微生物进行培养前，需要对微生物和培养基进行灭菌C酵母菌发酵过程产生的酒精，对其他微生物生长有一定的抑制作用D分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源解析：选B在对微生物进行培养前，需要对培养基进行灭菌，不能对所培养的微生物进行灭菌。2做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是()A高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖B倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上C为了防止污染，接种环经火焰灭菌后
2、应趁热快速挑取菌落D用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上解析：选D在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的指针指到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子；倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边；接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落；在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。3下列关于统计菌落数目方法的叙述，错误的是()A采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的菌落数B当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落C为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数D在某一浓度下涂布三个平板，若
3、三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果解析：选C当两个或多个活菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。一般选择菌落数在30300的平板计数，密度过大会使计数结果偏小，影响结果的准确性。至少涂布3个平板，作为重复组，取其平均值计数能增强实验的说服力和准确性。4以下关于分离纤维素分解菌的实验操作错误的是()A经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上B选择培养这一步可省略，但得到的纤维素分解菌会较少C可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量D对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到含纤维素的培养基
4、上解析：选A经选择培养后，再经梯度稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略，但培养分离的纤维素分解菌较少；纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定；实验组和对照组遵循单一变量原则，对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到含纤维素的培养基上，设置对照组能证明经“浓缩”培养的确得到了欲分离的微生物。二、非选择题5(2019届西安一模)环境污染物多聚联苯难以降解，受到多聚联苯污染的土壤中，常有重金属污染同时存在。研究发现联苯降解菌内的联苯水解酶是催化多聚联苯降解的关键酶。为了从富含多聚联苯的环境中分离联苯降解菌，某同学设计了甲、乙两
5、种培养基(成分见表)：维生素NH4NO3MgCl2多聚联苯水琼脂培养基甲培养基乙注：表示添加该物质，表示没有添加该物质。(1)甲培养基中加入多聚联苯作为_用于培养联苯降解菌，该培养基属于_(填“选择”或“鉴别”)培养基。接种前需对甲培养基采用_法进行灭菌。(2)培养基乙_(填“能”或“不能”)用于测定联苯降解菌的数量，原因是_。统计联苯降解菌数量时，应进行多组实验，再_。(3)联苯降解菌在实验室里的降解率很高，但是实际污染环境的治理中降解率很低，这可能是因为_(答出一种可能即可)。解析：(1)分析表格，甲培养基中加入多聚联苯作为唯一碳源用于培养联苯降解菌，因此该培养基属于选择培养基。接种前需对
6、甲培养基采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)培养基乙没有加入琼脂，属于液体培养基，可以在其中培养联苯降解菌，采用显微计数法测量联苯降解菌数量。统计联苯降解菌数量时，应进行多组实验，再取平均值。(3)联苯降解菌在实验室里的降解率很高，但是实际污染环境的治理中降解率很低，这可能是因为实际污染环境中多聚联苯不是唯一碳源或其他污染物(如重金属等)导致联苯水解酶的数量或活性降低。答案：(1)碳源选择高压蒸汽灭菌(2)能培养基乙为液体培养基，可以在其中培养联苯降解菌，采用显微计数法测量联苯降解菌数量取平均值(3)实际污染环境中多聚联苯不是唯一碳源或其他污染物(如重金属等)导致联苯水解酶的数量或活性降低(意思
7、接近即可)6(2019届瑞金模拟)常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖进行酒精发酵，自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，科学家欲从果园的葡萄上或土壤中分离这种酵母菌，操作如下：(1)制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是_。(2)纯化菌株的过程中，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是_。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误是_。(3)若要检测土样中的酵母菌数量，应采用_法接种。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养基
8、先行培养了一段时间，这样做的目的是_。然后，将1 mL土壤溶液分别稀释10倍和100倍，每种稀释度各3个平板，分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，6个平板上的菌落数分别为59、57、58、2、7和5，据此可得出每升土壤溶液中的活菌数为_个。解析：(1)为了防止培养皿盖的冷凝水落入培养基造成污染，制备酵母菌培养基要进行倒平板操作。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是接种环。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做可以将聚集的菌落逐步减少以获得单个菌落。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，造成划线
9、无菌落可能的操作失误是接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始。(3)若要检测土样中的酵母菌含量，应采用稀释涂布平板法。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养基先行培养了一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格。稀释涂布平板法中，一般选用菌落数在30300的平板进行计数，因此采用稀释10倍的菌落数分别为59、57、58的平板进行计算，据此可得出每升土壤溶液中的活菌数(595758)310(0.1103)5.8106个。答案：(1)防止培养皿盖的冷凝水落入培养基造成污染(2)将聚集的菌落逐步分散以获得单个菌落接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始(3)稀释涂布平板检测培养基平板灭菌
10、是否合格5.81067自生固氮菌可不与其他植物共生，独立完成固氮作用，在农业生产中具有广泛的用途。研究人员欲从土壤中筛选高效的自生固氮菌株进行研究。请回答下列问题：(1)在配制含琼脂的培养基和倒平板的过程中，下列选项不需要的是_(填序号)。酒精灯接种环高压蒸汽灭菌锅棉塞(2)要从土壤样品中分离出自生固氮菌，在获得土壤浸出悬液后，可以采用稀释涂布平板法将菌液涂布于_培养基上进行筛选。在如图所示的四种菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是_。(3)稀释涂布平板法还可用于检测土壤中自生固氮菌的含量，图中用该方法得到的菌落分布图中，最符合计数要求的是图中的_。用该方法统计样本菌落数时是否需要设置对照组
11、？_。为什么？_。(4)将1 g土样稀释103倍后分别取0.1 mL土壤浸出液，涂布到3个琼脂固体培养基的表面进行培养，记录到自生固氮菌的菌落平均数为130。则每克土样中自生固氮菌为_。该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是_。解析：(1)平板培养基配制的基本流程为：计算称量溶化(包括琼脂)调节pH分装灭菌倒平板(冷却后)倒置平板，不需要接种环接种。(2)对微生物进行分离和计数，应该用稀释涂布平板法。自生固氮菌是指在土壤中能够独立进行固氮的细菌，所以培养基中不需要添加氮源。图D是平板划线法得到的平板，所以稀释涂布平板法接种不可能得到D的情况。(3)符合计数要求的平板中的菌落数应该在3
12、0300之间，所以图中最符合要求的是平板C。由于需要判断培养基是否被污染，所以用该方法统计样本菌落数时需要设置对照组。(4)由于平板上自生固氮菌的菌落平均数为130，所以每克土样中自生固氮菌为1300.11031.3106(个)。由于当两个或多个细胞连在一起时，在平板上形成的只是一个菌落，所以该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。答案：(1)(2)缺氮D(3)C需要培养基制备不合格会导致菌落数增加(4)1.3106当两个或多个细胞连在一起时，在平板上形成的只是一个菌落B级提升练一、选择题1下表表示某培养基的配方，下列叙述正确的是()成分蛋白胨葡萄糖KH2PO4伊红美蓝蒸馏水含量10 g10
13、 g2 g0.4 g0.065 g1 000 mLA.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基B培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨C该培养基缺少提供生长因子的物质D该培养基调节合适的pH后就可以接种解析：选B从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基；微生物的营养物质主要包括氮源、碳源、水和无机盐等，培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨；生长因子主要包括维生素、氨基酸和碱基等，它们一般是酶和核酸的组成成分，蛋白胨可以提供生长因子；该培养基调节合适的pH后还需经灭菌后才可以接种使用。2.如图是微生物平
14、板划线示意图，划线的顺序为12345，下列说法正确的是()A操作前要将接种环用酒精消毒B划线操作须在酒精灯火焰上方进行C只有在5区才可以得到所需菌落D在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌解析：选D在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在酒精灯火焰上灼烧，不能用酒精消毒；接种时划线操作是在酒精灯火焰附近进行；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落；每次划线前都要灼烧接种环，目的是杀死接种环上原有的微生物(第一次划线前)和上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，划线结束后灼烧接种环以防止污染环境和感染操作者。3取9
15、个洁净培养皿，均分为三组(、)，各组分别加入等量的不同培养基，每个平板均用涂布法接种0.1 mL大肠杆菌菌液，37 培养36 h后，统计菌落数(见表)，以下相关叙述正确的是()组别培养基各平板的菌落数123琼脂、C6H12O6、NH4NO3303127琼脂、C6H12O6、NH4NO3、维生素169178193琼脂、NH4NO3、维生素001A.组和组说明维生素可以促进大肠杆菌生长B组和组说明大肠杆菌正常生长需要糖类物质C三组实验均使用了液体培养基，以方便菌落计数D三组实验所使用的培养基均需62 、30 min消毒解析：选A由表格分析可知，组和组说明维生素可以促进大肠杆菌生长；组和组作对照，自
16、变量是葡萄糖的有无，说明大肠杆菌正常生长需要葡萄糖；由题意知，每个平板都含有琼脂，属于固体培养基；三组实验所使用的培养基均需高压蒸汽灭菌。4(多选)漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。如图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是()A生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品B筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落C在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化D斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株解析：选BC生活污水中含木质素的物质相对较少，产漆酶菌株也较少，不宜作为分离产漆酶菌株的样品；产漆酶菌株可降解木质素
17、，在筛选培养基中加入木质素可筛选产漆酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出产漆酶的菌落；在涂布平板上生长的菌落可能还有其他杂菌，可再通过平板划线法进一步纯化；对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法，即在20 的冷冻箱中保存。二、非选择题5资料表明：培养液pH4.5时，酵母菌的代谢活动会逐渐受到抑制，甚至停止；耐酸性酵母菌能在pH3.5的环境下继续表现出较强的发酵能力，适宜作为白酒发酵的生产菌种。为选育适合白酒生产的耐酸性强的酵母菌，研究者进行了相关实验，请回答下列有关问题：(1)河南杜康老酒制酒工艺中，在接种活菌前，清蒸稻皮的目的是_。随着发酵的进行，酒窖中培养液的pH会逐渐下降，原因是_
18、。(2)取窖底泥，溶于10 mL无菌水中，再取1 mL上清液接入一定量的麦芽汁培养基中，其目的是_。在此过程中先振荡摇匀，并通气培养的目的是_。(3)用稀释涂布平板法进行纯化培养统计的细菌数量往往较实际值偏小的原因是_。通过培养选育得到了三个耐酸性较强的酵母菌菌株，特点如下表。菌株甲菌株乙菌株丙菌株特点pH3.5时，生长代谢正常、优于其他常规菌种pH3.5时，生长代谢正常，pH为46时生长不正常pH为2.56时，生长代谢正常、优于其他常规菌种依据菌株特点，研究者认为_菌株更适合作为白酒发酵菌株，理由是_。解析：(1)在接种活菌前，清蒸稻皮的目的是去除杂菌(或灭菌)。随着发酵的进行，酵母菌细胞呼
19、吸产生CO2，CO2溶于水形成碳酸，代谢过程还产生了其他酸性物质，导致培养液的pH逐渐下降。(2)取窖底泥，溶于10 mL无菌水中，再取1 mL上清液接入一定量的麦芽汁培养基中，其目的是使酵母菌大量繁殖。由于酵母菌是兼性厌氧菌，因此在培养时通气的目的是使酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。(3)用稀释涂布平板法统计细菌数量时，由于两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的细菌数量往往较实际值偏小。三个耐酸性较强的酵母菌菌株中，由于丙菌株对pH的耐受范围更大(发酵初期pH近中性，丙菌株适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期pH逐渐降低，丙菌株依然能正常生长)，因此丙菌株更适合作
20、为白酒发酵菌株。答案：(1)去除杂菌(或灭菌)细胞呼吸产生CO2，可形成碳酸；代谢过程还产生了其他酸性物质(2)扩大培养(或使酵母菌大量繁殖)使酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖(3)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落丙丙菌株对pH的耐受范围更大(发酵初期pH近中性，丙菌株适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期pH逐渐降低，丙菌株依然能正常生长)6(2019届诸暨市期末)幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化道溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：配制培养基灭菌、倒平板接种培养观察。请回答：(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指
21、示剂，这是因为Hp含有_，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现红色环带。(2)高压蒸汽灭菌加热结束时，待高压锅或灭菌锅_时，开启锅盖。(3)接种时，先将菌液用_稀释，然后用_取0.1 mL稀释液加到培养皿中，再用玻璃刮刀涂布到整个平面上。(4)在培养时，需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，培养皿需用记号笔在_(填“皿盖”或“皿底”)做好标记。(5)观察时发现，若实验操作都正确规范，但通过菌落计数计算，稀释倍数高的组计算结果往往大于稀释倍数低的组，导致这种结果的原因最可能是_。(6)临床上14C呼气试验检测是一种安全、准确的检测Hp的方法，其基本原理是当被检测者服用含有14C标记的尿素的
22、胶囊后，如被检测者的胃内存在Hp感染，则可检测到被标记的_。解析：(1)由于Hp在分解尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，在培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红。(2)高压蒸汽灭菌加热结束时，待高压锅或灭菌锅压力与大气压相同时，开启锅盖。(3)接种时，先将菌液用无菌水稀释，然后用移液管取0.1 mL稀释液加到培养皿中，再用玻璃刮刀涂布到整个平面上。(4)在培养时，需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，培养皿需用记号笔在皿底做好标记。(5)观察时发现，若实验操作都正确规范，但通过菌落计数计算，稀释倍数高的组计算结果往往大于稀释倍数低的组，原因可能是稀释倍数低的组菌液
23、浓度更大，可能出现多个细菌连在一起形成一个菌落，导致菌落计数偏低。(6)临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2。答案：(1)脲酶(2)压力与大气压相同(3)无菌水移液管(4)皿底(5)稀释倍数低的组菌液浓度更大，可能出现多个细菌连在一起形成一个菌落，导致菌落计数偏低(6)二氧化碳7(2019届无锡期末)成年大熊猫是以竹子(高纤维食物)为主的珍稀动物。大熊猫对纤维素的消化主要是由肠道微生物来完成的。科研人员从大熊猫粪便中筛选出能够降解纤维素的菌株(目的菌)，并对该菌株进行鉴定和产酶条件的优化，具体流程如图1。请回答下列问题：(1)
24、制备牛肉膏蛋白胨培养基需经过计算称量溶化_倒平板等步骤。大熊猫粪便样品通过富集培养，可增加_，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。(2)将富集培养后的大熊猫粪便混合菌液适当稀释后涂布于以_作为唯一碳源的选择培养基上，倒置放入37 培养箱中培养24 h。培养完成后滴加_染色，观察培养基上是否产生_，再通过比较其大小，初步获得目的菌株。(3)将初步获得的目的菌株通过滤纸分解实验进一步验证筛选，其是否可以作为生产菌株仍需进行菌株鉴定，菌株鉴定通常通过观察记录菌落的_等特征进行。(4)为确定最终获得的目的菌株的最佳产酶条件，首先选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量(250 mL三角瓶)
25、4个因素开展单因素实验，实验结果如图25所示。培养基pH和培养温度都会影响目的菌株产酶，主要原因是这些因素会影响_。摇床转速和装液量都可以影响培养液中_的含量，进而影响目的菌株产酶。根据以上实验结果，可初步判断目的菌株产纤维素酶的适宜条件是_，如要进一步确定菌株的最佳产酶条件还需要进行复合因素的实验。解析：(1)制备牛肉膏蛋白胨培养基的基本流程为：计算称量溶化灭菌倒平板等步骤。大熊猫粪便样品中含有降解纤维素的菌株，通过对该样品的富集培养，可增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。(2)为了获得纤维素分解菌的菌种，就要人为提供有利于该微生物的生长条件，同时抑制或阻止其他微
26、生物的生长，因此所用的选择培养基应以纤维素(羧甲基纤维素钠)作为唯一碳源，以便进行选择培养。刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶水解后，刚果红纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，为了能够初步获得目的菌株，可以在微生物培养完成后滴加刚果红进行颜色反应，根据菌落周围是否产生透明圈、以及透明圈的大小来筛选纤维素分解菌。(3)通过滤纸分解实验对初步获得的目的菌株进行进一步的筛选鉴定，通常通过观察记录菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴定。(4)酶活性受pH和温度等因素的影响。培养基的pH和培
27、养温度对目的菌株产酶的影响是通过影响酶活性来实现的。摇床转速和装液量对目的菌株产酶的影响是通过影响培养液中溶解氧的含量来实现的。图2至图5显示，当培养基初始pH为6.5、培养温度为35 、摇床转速为125 r/min、250 mL三角瓶装液量为120 mL时滤纸酶活力最高，这些条件即为目的菌株产纤维素酶的适宜条件，如要进一步确定菌株的最佳产酶条件还需要进行复合因素的实验。答案：(1)灭菌纤维素分解菌的浓度(2)纤维素(羧甲基纤维素钠)刚果红透明圈(3)形状、大小、隆起程度和颜色(4)酶活性溶解氧培养基初始pH为6.5，培养温度为35 ，摇床转速为125 r/min，250 mL三角瓶装液量为120 mL
