1、一、基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定。二、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2获取目的基因的依据基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色体上的位置，基因的转录产物mRNA，基因的表达产物蛋白质。3目的基因的获取方法(1)从基因文库中获取目的基因基因文库含义：将含有某种生物不同基因的许多 DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。基因文库种类(2)利用PCR技术扩增目的基因PCR技术全称是多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片
2、段的核酸合成技术。原理：DNA双链复制。扩增过程变性：目的基因DNA受热变性后解链为单链 复性：引物与单链相应互补序列结合 延伸：在DNA聚合酶作用下延伸子链(3)人工合成法：适于合成基因较小，且核苷酸序列已知的目的基因。三、基因表达载体的构建基因工程的核心1基因表达载体的组成(1)目的基因。(2)启动子(3)终止子(4)标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因。2.基因表达载体的功能(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够表达和发挥作用。四、将目的基因导入受体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2导入不同类型生物细
3、胞的方法(1)导入植物细胞方法受体细胞：植物体细胞。(2)导入动物细胞(3)导入微生物细胞方法：用 Ca2处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌细胞)。原核生物的特点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少等。五、目的基因的检测与鉴定1分子水平上的检测与鉴定(1)DNA分子杂交技术(2)抗原抗体杂交技术：用于检测目的基因是否翻译出蛋白质。2个体生物学水平上的检测与鉴定如一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验。 共研探究1目的基因的获取获取目的基因是
4、实施基因工程的第一步，随着科学技术的发展，目前获取目的基因的常用方法有以下几种。阅读教材相关内容，结合提供的资料，完成下面的思考。(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。(2)目的基因的获取方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增和人工合成三种。直接分离：从自然界中已有的物种中分离，如从基因文库中获取。a基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。b基因文库种类文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)无有基因多少某种生物的部分基
5、因某种生物的全部基因文库类型cDNA文库基因组文库物种间的基因交流可以部分基因可以c.基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库只含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库。人工合成法：如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过 DNA合成仪用化学方法直接人工合成。人工合成包括利用DNA进行化学合成和反转录法。利用PCR技术扩增目的基因的条件、过程a原理：DNA复制。b前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。c条件：DNA模板、引物、热稳定DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。d过程：2DNA复制与PCR技术的比较DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温作用下变
6、性解旋场所细胞内细胞外酶解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐热的DNA聚合酶(Taq酶)温度条件细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行合成的对象DNA分子DNA片段或基因总结升华获取目的基因方法的比较方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成过程供体细胞中的DNA限制酶许多DNA片段连接表达载体导入受体细胞外源DNA扩增，产生特定性状分离目的基因目的基因的mRNA反转录单链DNA合成双链DNA插入载体导入受体菌群 (cDNA文库)分离目的基因蛋白质的氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测基因的核苷酸序列 化学合成目的基因优点操作简单专一性强可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生自然界中不存在
7、的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高需要严格控制温度、技术要求高适用范围小联系模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成原料：均为四种脱氧核苷酸酶：均需要DNA聚合酶进行催化引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸对点演练1下列不属于获取目的基因的方法是()A利用DNA连接酶复制目的基因B反转录法C从基因文库中获取目的基因D利用PCR技术扩增目的基因解析：选A对目的基因(DNA片段)进行复制需利用DNA聚合酶而不是DNA连接酶。共研探究1基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受
8、体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。依图填空，并回答有关问题。(1)构建基因表达载体的目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因能够表达和发挥作用。(2)构建基因表达载体的过程：目的基因与载体结合的过程，实质上是不同来源的DNA重新组合的过程。其过程如下：(3)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子相同吗？提示：不相同，启动子和终止子位于DNA上，是基因表达必需的部分。起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。(4)基因表达载体的构建需要限制酶、DNA连接酶。【归纳拓展】真核细胞基因结构(1)结构：编码区：内含
9、子、外显子；非编码区：启动子、终止子。基因结构如图所示：(2)表达：只有编码区能转录生成RNA，且内含子转录的部分要剪切掉，即转录生成的mRNA只有外显子的对应部分。因此，以mRNA为模板，反转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。2将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。结合图1、图2、图3，根据教材相关内容完成下列思考。(1)结合图示理解农杆菌转化法的过程(2)将目的基因导入受体细胞的方法生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞受精
10、卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞融合到受体细胞的DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(3)为什么植物的体细胞可以作为受体细胞，而动物的体细胞不能作为受体细胞？提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体；动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体，因此动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。(4)从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？提示：不可以。因为糖蛋白上的糖
11、链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。总结升华【易错易混】(1)构建基因表达载体用同一种限制酶切割质粒和目的基因，以获得互补的黏性末端，利于重组质粒的构建。插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。终止子是DNA分子上决定转录停止的DNA序列；终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基。(2)农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒上TDNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的TDNA被拼
12、接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA进入受体细胞。对点演练2如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是()A基因工程的核心步骤是基因表达载体构建B任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因解析：选B由于受体细胞有植物、动物和微生物，所以目的基因导入受体细胞的方式不同，因此，基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的。3科学家通过基因工程的方法
13、，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株抗虫棉。其过程大致如图所示，请分析回答：(1)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti质粒的TDNA中是利用TDNA_的特点。(2)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为_。(3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是_。解析：(1)Ti质粒的最大优点是能将目的基因导入受体细胞的染色体DNA中，从而使目的基因在棉花体内稳定维持和表达。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(3)将目的基
14、因导入植物细胞方法很多，以农杆菌中的Ti质粒为目的基因载体的称为农杆菌转化法。答案：(1)可转移至受体细胞并且融合到受体细胞染色体DNA上(2)转化(3)农杆菌转化法共研探究目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否做成功的一步。结合下述材料，完成探究。1目的基因的检测(分子水平检测)(1)从图中分析可得检测目的基因的方法为DNA分子杂交技术，其原理是采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；若没有互补碱
15、基序列的部位，仍然是两条游离的单链。(2)分子检测的方法DNA和DNA分子之间的杂交。目的基因是否融合到受体生物的染色体DNA中，这是真核生物中的目的基因可否稳定存在和遗传的关键。要验证这一点，就需要通过DNA和DNA分子间的杂交技术。主要做法是用放射性同位素标记目的基因DNA片段作探针，以此检测受体细胞的DNA中有无目的基因。DNA和RNA分子之间的杂交。它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法是从转基因生物中提取mRNA，用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA，意味着目的基因开始发挥功能。蛋白质分子(抗原抗体)之间的杂交。具体做法
16、是：用相应的抗体进行抗原抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经表达出了蛋白质。2鉴定(个体生物学水平鉴定)观察图示，判断抗虫棉的接种实验属于个体生物学水平鉴定，通过做抗虫(或抗病)的接种实验以确定是否具有抗性及抗性的程度。还可对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。3应用(1)检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。如果棉铃虫死亡，说明抗虫基因已经表达；否则，目的基因没有表达。(2)DNA分子杂交的原理是碱基互补配对原则。DNA分子杂交可用于亲子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关系鉴定等。总
17、结升华1目的基因的检测与鉴定2不同分子检测的原理、场所、探针的异同(1)原理：进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物细胞内的mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。(2)场所：不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。(3)探针：在DNA分子、mRNA分子水平上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。【易错易混】基因工程的几个易错点(1)在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不涉及碱基互补配对
18、，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。(2)原核生物繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常采用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。对点演练4目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()检测受体细胞是否有目的基因检测受体细胞是否有致病基因检测目的基因是否转录出mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质ABC D解析：选C目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针与基因组DNA杂交；检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用基因探针与mRNA杂交；检测目的基因
19、是否翻译成蛋白质，方法是进行抗原抗体杂交。1下列关于基因文库的说法，错误的是()A可分为基因组文库和部分基因文库BcDNA文库属于部分基因文库C基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流D同种生物的cDNA文库基因数量较基因组文库基因数量少解析：选C基因组文库只有部分基因能够在不同物种之间进行交流。2基因表达载体的必需组成部分是()启动子终止密码子标记基因目的基因终止子ABC D解析：选B启动子位于基因表达载体的首端，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质；终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来；标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目
20、的基因的细胞筛选出来；目的基因是基因表达载体上必须具有的结构。3下列关于目的基因检测与鉴定的叙述，错误的是()A可以根据受体细胞是否具有某种抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因B受体细胞必须表现出目的基因控制的特定性状，才能说明目的基因完成了表达过程C目的基因检测的第一步是检测目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA上D检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作成功解析：选D目的基因成功导入受体细胞只是基因工程操作成功的必要一步，标志着基因工程操作成功的是目的基因在受体细胞中成功表达。4如图表示基因工程的主要操作步骤，请据图回答问题。(1)过程是_，需要_酶参与；过程是_，需要_酶参与。
21、 (2)过程中使用Ca2处理受体细胞可以增大_，使重组质粒进入受体细胞。 (3)重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须_，才能说明目的基因完成了表达过程。 (4)不同生物的基因能够进行重组，原因是_。 解析：分析图示可知：过程是获取目的基因，该过程需要的酶是限制酶；过程是构建基因表达载体的过程，该过程需要用到DNA连接酶。若受体细胞是微生物细胞，将重组质粒导入时，首先应用Ca2处理受体细胞，可以增大细胞膜的通透性，使重组质粒易于进入受体细胞。目的基因完成表达的标志是受体细胞内合成了相应的蛋白质。不同生物之间能够进行转基因，其原因应从基因的化学组成和空间结构两方面考虑。答案：(1)获取目的基
22、因限制构建基因表达载体DNA连接(2)细胞膜的通透性(3)表达出目的基因产物(4)不同生物的DNA具有相同的化学组成和空间结构【基础题组】1下列有关目的基因获取的理解，不正确的是()A目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成B目的基因主要指编码蛋白质的结构基因C基因文库就是基因组文库DcDNA文库只含有某种生物的一部分基因解析：选C基因文库又分为基因组文库和部分基因文库。cDNA文库是部分基因文库。2下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是()A需要限制酶和DNA连接酶B必须在细胞内进行C抗生素抗性基因可作为标记基因D启动子位于目的基因的首端解析：选B基因表达载体的构建是指目的基因与载
23、体结合，在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将互补的末端连接起来；基因表达载体的构建是在细胞外进行的；基因表达载体包括启动子(位于基因首端使转录开始)、终止子、目的基因和标记基因。3利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测()A是否有抗生素产生B是否有目的基因表达C是否有抗虫的性状出现D是否能分离到目的基因解析：选C要检验导入了抗虫基因的棉花植株是否抗虫，需要做抗虫的接种实验，以确定棉花是否有抗虫的性状出现，如果有抗虫的性状出现，则说明抗虫棉培育成功。4在基因工程技术中，需要用Ca2处理的环节是()A目的基因的提取和导入B目的基因与载体结合C将目的基因
24、导入受体细胞D目的基因的检测与鉴定解析：选C如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用Ca2处理，以增大细菌细胞膜的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。5将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，常采用的方法分别是()A显微注射法、农杆菌转化法B基因枪法、花粉管通道法C农杆菌转化法、显微注射法D基因枪法、显微注射法解析：选D玉米是单子叶植物，常用的转化方法是基因枪法；对于动物细胞，常用的转化方法是显微注射法。6下列关于cDNA文库和基因组文库的说法，不正确的是()AcDNA文库中的DNA来源于mRNA的反转录B如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个
25、基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同CcDNA文库中的基因都没有启动子D一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种解析：选B由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以mRNA反转录成的DNA就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编码区段，和原来的基因结构不相同。7利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白解析：选D目的基因的表达是指在受体细胞中产生了目的
26、基因所控制合成的蛋白质。在受体细胞中检测到目的基因或其转录产物RNA，并不能表明目的基因已经成功表达。8下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述，不正确的是()A常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少B受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态C感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度D感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液解析：选D将基因表达载体导入微生物细胞时，需在一定条件(如适宜的温度、pH等)下，将基因表达载体和感受态的微生物细胞混合培养，在培养过程中，可能会影响pH的变化，
27、因此要加入缓冲液，以保持适宜的pH。【能力题组】9(2014重庆高考)如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是()A的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到的染色体上C的染色体上若含抗虫基因，则就表现出抗虫性状D只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异解析：选D构建重组质粒需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶。含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒的TDNA整合到受体细胞的染色体上，而不是重组Ti质粒整合到受体细胞的染色体上。导入受体细胞的目的基因表达后，转基因植株方能表现出相应性状，若目的基因在受
28、体细胞中不表达，转基因植株不能表现出相应性状。表现出抗虫性状则表明该植株细胞发生了基因重组，基因重组是可遗传变异。10天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B，现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是()A提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经过反转录获得互补的DNA，再扩增基因BB利用限制酶从开蓝色花牵牛的基因文库中获取基因BC利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞解析：选A由题意知：控制蓝色色素合成的基因B是目的基因，提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经反转录获得互补的DNA，再扩
29、增基因B，构建表达载体，然后导入天然玫瑰的细胞中，培育该受体细胞即能获得蓝玫瑰。从基因文库中获取目的基因，直接用引物扩增即可。将目的基因B与质粒连接需用DNA连接酶，而不是DNA聚合酶。基因B需与质粒连接形成基因表达载体再导入农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞，而不能将基因B直接导入大肠杆菌。11.质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内，某细菌质粒上的标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示外源基因在质粒中可插入的位置有a、b、c点。某同学根据实验现象对其插入的位点进行分析，其中分析正确的是
30、()实验现象实验推论在含青霉素培养基上的生长情况在含四环素培养基上的生长情况目的基因插入的位置A能生长能生长aB不能生长能生长bC能生长不能生长cD不能生长不能生长c解析：选B若质粒上插入的位置在b点，那么抗四环素基因没有被破坏，抗青霉素基因被破坏，导入该重组质粒的细菌在含青霉素的培养基上不能生长，在含四环素的培养基上能生长。12某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒导入大肠杆菌细胞，使其表达，产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是()A导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒BRN
31、A聚合酶是构建该重组质粒必需的工具酶C可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D在含氨苄青霉素的培养基中不能生长，但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌解析：选D基因操作过程中，用同一种限制酶分别切割生长激素基因所在的DNA分子和质粒后，会产生相同的黏性末端，黏性末端连接时，目的基因和目的基因、目的基因和质粒、质粒和质粒都可能连接，因此，导入大肠杆菌的质粒不一定为重组质粒。构建该重组质粒必需的工具酶是限制酶和DNA连接酶。目的基因插入基因B中后形成的重组质粒的抗氨苄青霉素基因被破坏，故导入了重组质粒的大肠杆菌对氨苄青霉素不具有抗性，对链霉素仍具有抗性。13如图
32、是利用基因工程方法培育抗虫棉的过程。请回答相关问题：土壤农杆菌(1)从苏云金芽孢杆菌的DNA上获取抗虫基因，需要用到的工具是_，此工具主要是从_生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的_键断开。(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有_，它能把目的基因整合到受体细胞的_上。(3)E过程是利用植物组织培养技术完成的，要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做_实验。(4)将目的基因导入植物细胞，除采用图示中的方法外，还可以采用_法和花粉管通道法。解析：(1)限制酶用于
33、切割DNA分子，获取目的基因。限制酶主要从原核生物细胞中获取。限制酶可使磷酸二酯键断裂，将DNA分子切开。(2)Ti质粒是可转移DNA，其上的TDNA可以整合到植物细胞的染色体DNA上，故将目的基因借助Ti质粒导入植物细胞中。(3)把害虫接种到转基因植株上，以检测转基因植株的抗虫基因是否正常表达。答案：(1)限制酶原核磷酸二酯(2)TDNA染色体DNA(3)抗虫的接种(4)基因枪14(2015四川高考)将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有TDNA片段能转移到植物细胞中)。(1)过程需用同种_酶对含Bt基因的DNA和Ti质
34、粒进行酶切。为将过程获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用_培养基。(2)过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让_进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是_。(3)若过程仅获得大量的根，则应在培养基中增加_以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是_。(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是_。种植转基因抗虫棉能减少_的使用，以减轻环境污染。解析：(1)切割目的基因和载体应使用同种限制性核酸内切酶，筛选细菌应使用选择培养基。(2)农杆菌转化法的原理是农杆菌感染植物时，Ti质粒上的TDNA片段能够转移并整合到植物细胞的染色体DNA上。因为T
35、DNA上具有卡那霉素抗性基因，所以可用含卡那霉素的培养基筛选出获得TDNA片段的植物细胞。(3)植物组织培养过程中，可加入激素调节植物细胞的脱分化和再分化。生长素用量与细胞分裂素用量比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成。幼嫩的芽顶端可以产生生长素并向基部运输，促进根的分化，故芽在无激素的培养基中也可以生根。(4)在个体水平上检测抗虫棉时可在抗虫棉上投放害虫来判断其是否具有抗虫的性状；抗虫棉因具有抗虫性状，故可减少农药的使用，以减轻环境污染。答案：(1)限制性核酸内切选择(2)TDNA筛选获得TDNA片段的植物细胞(3)细胞分裂素浓度芽顶端合成的生长素向
36、基部运输，促进根的分化(4)投放棉铃虫农药15(全国丙卷)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR 、BamH 和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。图(b)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接
37、起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)由题图可知，BamH和Sau3A两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有Ecoli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。答案：(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案可酌情给分)(3)Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶(其他合理答案可酌情给分)
