1、荧光定量 PCR 仪（ABI7500）操作规程及日常维护曹蕾马扬光施小明【摘 要】介绍了荧光定量 PCR 仪（ABI7500）操作规程，总结了其日常维护和注意事项，为其使用提供指导。【关键词】荧光定量 PCR 仪 操作规程 维护荧光定量 PCR 仪将 PCR 热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察 PCR 每一循环各反应管中 PCR 扩增产物逐渐增加的情况。1 原理介绍实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法1。荧光染料法：荧光染料能特异性掺人 DNA 双链，
2、发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物增加完全同步1。荧光探针法：探针的 5 端标记荧光报告基团（reporter R）3 端标记淬灭基团（quencher Q），探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5-3 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成完全同步1 2。通常，荧光擴增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号
3、指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为ct 值。模板的 ct 值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则 ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的 ct 值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct 值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数3。2 操作规程2.1 开机2.1.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入 Windows 界面。2.1.2 接着打开 AB7500 仪器电源开
4、关，预热 10 分钟。2.1.3 点击 SDS 软件。2.2 检测2.2.1 选择 File-New-新建，在 New Document Wizard 窗口中，从 Assay 下拉列表中选择反应类型：相对定量，绝对定量，等位基因鉴别或阳性阴性实验，从 Container 下拉列表中选择反应板类型，在 Default Plate Name 中输入反应板文件名，点击 Next，选择需要添加到反应板文件的探针，点击 Next，为每个孔指定探针和任务，单击 Finish。2.2.2 在 Well Inspector-View-Well Inspector 中输入样品名。2.2.3 运行相应的反应类型程
5、序，选择 Instrument 设定 PCR 条件。2.2.4 点击 Save 下拉菜单下的 Save As，输入文件名，点击 save，关闭设置界面。2.2.5 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测反应板放入检测孔位，再次按压托盘使其滑入仪器，点击 Start 开始检测。2.3 结果分析PCR 反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析，选择 Analysis-AnalysisSettings 选择 Auto Ct，软件自动为每个反应空生成基线和阈值，也可根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值，Threshold 值，点击 Analyze 进行再次分
6、析。2.4 关机实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭 AB7500 软件、定量 PCR 仪电源，关闭电脑3 日常清洁维护43.1 每周用无绒布块蘸取 75%酒精清洁仪器的表面。3.2 每周使用 75%酒精浸泡反应管托架（晾干后放回仪器内）。3.3 每月执行一次背景校准3.4 每半年检查灯具状态。在 7500 Software 中，选择 Instrument-LampStatus/Replacement 以确定卤素灯的状态：Condition 显示 Good 表示灯具工作良好，不需更换卤素灯；显示 Failed 表示卤素灯已坏，需更换；Change Soon 表示灯具使用超过 2000
7、 小时，建议将更换。3.5 在 PCR 仪运行之前或期间，7500 Software 可能显示警告，按警告要求进行目标区（ROI）校正、背景校准、光学校准、染料校准、RNase P 仪器验证试验等。参考文献1 钟江华，张光萍，柳小英.实时荧光定量 PCR 技术的研究进展与应用J.氨基酸和生物资源，2011，33（2）：6872.2 兰静，李秋根.实时荧光定量 PCR 技术理论研究及其在医学方面的应用J.南昌大学学报（医学版），2011，51（10）：97100.3 王志平.荧光定量 PCR 技术的原理与应用J.渭南师范学院学报，2012，27（10）：6164.4 魏建新.ABI7500 型荧光定量 PCR 仪的使用维护及故障排除J.中国卫生检验杂志，2015，25（21）：37803781.
