1、第二章细胞工程第一节动物细胞培养1简述动物细胞培养的基本条件和过程。(重点)2说明细胞株与细胞系的特点和区别。(难点)3简述动物细胞培养的意义。动 物 细 胞 培 养 的 概 念 与 基 本 条 件1动物细胞培养的概念细胞培养是细胞工程中最基础的技术，它是把机体的某一组织或器官取出，分散为单个细胞，使其在人工培养条件下继续生存、生长甚至增殖的过程。2细胞培养的基本条件(1)严格的无毒无菌条件离体培养的细胞已失去了对微生物和有毒物质的防御能力。(2)基本营养物质和生长因子(3)适宜的温度和酸碱度(4)气体环境探讨：动物细胞培养时采取哪些措施得到无菌、无毒的环境？提示：(1)对培养液、所有的培养用
2、具进行无菌处理。(2)在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。(3)定期更换培养液，以清除代谢产物，防止对细胞自身造成伤害。探讨：动物细胞进行培养时为什么通常添加动物血清？提示：血清中由于含有许多未知成分，会对细胞的生长和增殖有促进作用。一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件：(1)无菌、无毒的环境；(2)营养，如需要糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分；(3)适宜的温度和pH；(4)适宜的气体环境。1下列关于动物细胞培养液的叙述，不正确的是()A为了防止培养过程中出现细菌污染，可以在培养液中添加抗生素B细胞培养液中
3、必须有糖、氨基酸等化合物以及动物血清等天然成分C空气中再混入5%的CO2主要作用是维持培养液的pHD培养液应该定期更换防止代谢产物积累对细胞自身造成危害【解析】动物细胞培养液通常需要加入动物血清、血浆，有时也采用无血清培养。【答案】B2体外培养小鼠肝脏细胞，对于研究器官的生理、病理过程及其机制意义重大。下图是一个培养新鲜小鼠的肝脏的装置示意图。请回答下列问题。(1)操作前，要将小鼠肝脏切成小薄片，并且用_酶处理，获得单个细胞，有利于肝脏细胞_。(2)图中的培养液相当于小鼠体内肝脏细胞直接生活的_，其理化性质主要包括_等三个方面。(3)气室中充入5%CO2和95%O2，其中O2的作用是_，其反应
4、式为：_。(4)在培养过程中要在无菌无毒的环境中进行，通常还选择合适的菌种，在培养液中添加一定量的抗生素，目的是_。此外还要定期更换培养液，以便清除_，防止对肝细胞造成伤害。(5)有机物X有毒性，可诱发染色体断裂。利用上图所示装置和提供的下列材料用具，探究肝脏小块对有机物X是否具有解毒作用。材料用具：肝脏小块，外周血淋巴细胞，淋巴细胞培养液，植物凝集素(刺激淋巴细胞分裂)；显微镜，载玻片，盖玻片，玻璃皿，滴管；吉姆萨染液(使染色体着色)，有机物X溶液等。实验过程：在淋巴细胞培养液中加入植物凝集素培养淋巴细胞，取4等份，备用。利用甲、乙、丙、丁4组按上图所示装置。按下表步骤操作(“”表示已完成的
5、步骤)。甲乙丙丁步骤一：加入肝脏培养液步骤二：加入有机物X溶液步骤三：放置肝脏小块上表中还需进行的操作是_，作为对照组。培养一段时间后，取4组装置中的等量培养液，分别添加到4等份备用的淋巴细胞培养液中继续培养。一段时间后取培养到_期的淋巴细胞分别染色、制片。在显微镜下观察_，并对比分析。若_，则说明肝脏小块对有机物X具有解毒作用。【解析】(1)将肝脏组织分解成单个细胞用胰蛋白酶处理，有利于肝脏细胞充分接触营养液，吸收氧气和营养物质、排出CO2和代谢废物。(2)培养液是细胞生活的直接环境，相当于内环境，内环境的理化性质包括渗透压、温度、酸碱度三个方面。(3)动物细胞培养的气体环境包括氧气和二氧化
6、碳，氧气的作用是细胞进行有氧呼吸所必需的，有氧呼吸反应式为C6H12O66O26H2O12H2O6CO2能量(4)培养基中加抗生素的作用是抑制细菌生长或者防止污染，定期更换培养液目的是清除肝细胞的代谢产物对肝细胞造成伤害。(5)由表中各步骤所加物质可知，缺少只向乙(或丁)组装置中放置与甲组等体积的小鼠肝脏小块的对照。植物凝集素能刺激淋巴细胞分裂，可用显微镜观察有丝分裂中期染色体的形态和数目来判断肝脏是否具有解毒作用，若丙组淋巴细胞出现异常，而甲组的淋巴细胞正常，则说明肝脏小块对有机物X具有解毒作用。【答案】(1)胰蛋白充分接触营养液，吸收氧气和营养物质、排出CO2和代谢废物(2)组织液(或内环
7、境)渗透压、温度、pH或者酸碱度(3)小鼠肝细胞进行有氧呼吸所必需反应式为：C6H12O66O26H2O12H2O6CO2能量(4)为了抑制细菌生长或者防止污染肝细胞的代谢产物(5)只向乙(丁)组装置中放置与甲组等体积的小鼠肝脏小块，而丙组不添加有丝分裂中染色体形态和数目丙组淋巴细胞出现异常，而甲组的淋巴细胞正常 动 物 细 胞 培 养 的 过 程 与 意 义1细胞培养的过程(1)过程图解(2)过程分析原理：细胞的有丝分裂。阶段：包括原代培养和传代培养两个阶段。培养细胞生长的特点：贴壁生长和接触抑制。培养结果：形成了细胞株或细胞系。冻存及复苏：保存细胞的措施主要是降低温度。复苏时，将冻存细胞迅
8、速放入37_温水中解冻。2细胞培养的意义(1)生产生物制品。如酶、生长因子、疫苗、单克隆抗体等。(2)进行有毒物质和药物的检测。(3)应用于临床治疗。如利用患者的皮肤细胞培养的人工皮肤，治疗大面积烧伤或烫伤病人，可避免免疫排斥反应。(4)应用于细胞生物学的研究。如细胞全能性的揭示等。动物细胞的培养过程可用下面的流程图表示：探讨：为什么要将动物组织分散成单个细胞？提示：分散后能与培养液充分接触，更易进行物质交换。探讨：动物胚胎或幼龄动物的器官或组织剪碎后用胰蛋白酶处理的目的是什么？提示：动物胚胎或器官剪碎后用胰蛋白酶分解组织细胞间质中的胶原蛋白，从而使组织分散成单个细胞。探讨：所有细胞的生长都存
9、在接触抑制吗？提示：癌细胞不具有接触抑制的特点。1培养过程(1)原理：细胞增殖。(2)选材：一般取自幼龄动物的器官或组织，因为这些组织或器官的生命力旺盛，分裂能力强。(3)将动物细胞分散成单个细胞培养的原因：保证细胞所需要的营养供应。保证细胞内有害代谢产物的及时排出。2相关概念的辨析(1)原代培养和传代培养：含义不同：a组织细胞分散成单个细胞后的初次培养称为原代培养。b细胞生长到贴满瓶壁时用胰蛋白酶处理，继续培养的过程称为传代培养。细胞增殖特点不同：a原代培养：细胞分裂旺盛，一般表现为细胞贴壁生长和接触抑制。b传代培养：传至1050代时，细胞增殖缓慢，甚至完全停止，此时细胞普遍表现为衰老和凋亡
10、特征，但也有少部分细胞会发生突变，会朝着等同于癌细胞的方向发展。(2)贴壁生长及接触抑制贴壁生长：动物细胞在液体培养基中悬浮生长一段时间之后，大部分细胞会贴附在培养瓶壁上生长。接触抑制：细胞进行有丝分裂，数目增加到表面相互接触时，停止分裂增殖，出现接触抑制现象。1下列有关动物细胞培养的叙述中，不正确的是()A用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织B将所取的组织先用胰蛋白酶等进行处理使其分散成单个细胞C在培养瓶中要定期用胰蛋白酶处理使细胞从瓶壁上脱离，制成悬浮液D动物细胞培养只能传50代左右，所培养的细胞会衰老死亡【解析】胚胎或幼龄动物的器官或组织细胞与成体细胞相比具有较强的分生能力，
11、所以动物细胞培养时一般采用胚胎或幼龄动物的器官或组织细胞；将所取的组织先用胰蛋白酶进行处理，因为胰蛋白酶可以分解组织细胞间质中的胶原蛋白，从而使组织分散成单个细胞，有利于进行培养；动物细胞培养传至50代左右，大部分会衰老、死亡，但有极少数细胞(细胞系)能够生存下来，可以继续培养。【答案】D2.回答下列有关动物细胞培养的问题。(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面_时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的_。此时，瓶壁上形成的细胞层数是_。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是_。(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现_的现象；但极少数
12、细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成_细胞，这种细胞的黏着性_，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量_。(3)在细胞培养过程中，通常在_条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中_的活性降低，细胞_的速率降低。(4)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作_进行攻击。【解析】(1)动物细胞培养过程中具有贴壁生长和接触抑制的特点，若要进行传代培养应先用胰蛋白酶处理，使其从瓶壁上分离下来。(2)在传代培养过程中，随着传代次数的增多，绝大多数细胞停止分裂，进而衰老甚至死亡，极少数细胞遗传物质发生改变，克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这种细
13、胞黏着性降低，细胞膜表面的蛋白质(糖蛋白)减少。(3)低温可以抑制酶的活性，从而降低细胞的新陈代谢速率。(4)皮肤移植后发生排斥反应，是因为机体把移植的皮肤组织当作抗原进行攻击。【答案】(1)相互接触接触抑制单层(或一层)胰蛋白酶(2)衰老甚至死亡不死性降低减少(3)冷冻(或超低温、液氮)酶新陈代谢(4)抗原1在动物细胞培养过程中，下列处理不恰当的是() 【导学号：99310021】A培养液和培养用具要进行无菌处理B提供种类齐全的营养物质C提供纯氧以保证细胞的呼吸作用D保证提供适宜的温度和pH【解析】动物细胞培养需要无菌条件，因此培养液和培养用具要进行无菌处理，故A正确；动物细胞新陈代谢需要各
14、类营养物质，因此需要提供种类齐全的营养物质，故B正确；动物细胞培养需要一定的气体环境，即95%的氧气和5%的二氧化碳，故C错误；动物细胞培养需要适宜的温度和pH，故D正确。【答案】C2在动物细胞培养中下列叙述正确的是()A动物细胞培养的目的是获得大量的细胞分泌蛋白B动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散C细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中D培养至50代后能继续传代的传代细胞叫细胞株【解析】动物细胞培养的目的是获得大量的细胞；细胞遗传物质的改变发生于传代细胞的细胞系中；培养至50代后仍能继续传代的传代细胞叫细胞系。【答案】B3.右图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答。(1)容器A中
15、放置的是动物器官或组织。它一般取自_。(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是_，然后用_酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是_。(3)培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有_等。(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用_处理，然后配制成_，再分装。(5)在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞增殖缓慢以至于完全停止，少数细胞_发生变化获得不死性。【答案】(1)胚胎或幼龄动物的器官或组织(2)剪碎组织胰蛋白使细胞与培养液充分接触(3)促生长因子、糖、氨基酸、无机盐和动物血清(4)胰蛋白酶细胞悬液(5)形态、结构(或遗传物质)4某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定
16、药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其它培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量_。(2)在动物细胞培养时，为了补充合成培养基中缺乏的物质，通常在合成培养基中加入适量的_。细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是_。(3)在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长_。药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更_。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用_消化处理。 (4)已知癌
17、细胞X基因过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗肿瘤药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A、B两组，A组细胞培养液中加入_，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，经培养后，从A、B两组收集等量细胞，通过分别检测X基因在A、B两组细胞中的_或_合成水平的差异，确定Y的药效。【解析】(1)因为甲细胞是癌细胞，没有接触抑制现象，所以一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量多；(2)在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量动物血清，因动物细胞所需要的有些物质还不清楚；细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是维持培养液pH；(3)乙细胞铺满瓶壁时，其生长停止，因发生了接触抑制
18、；甲细胞比乙细胞可以传代的次数更多；肝脏组织块制备肝细胞悬液用胰蛋白酶消化处理，使细胞分散开，以利于培养；(4)A组细胞培养液中加入Y作为实验组；通过分别检测X基因在A、B两组细胞中的转录产物mRNA或表达产物相应的蛋白质合成水平的差异，进而确定Y的药效。【答案】(1)多(2)动物血清维持培养液pH(3)停止多胰蛋白酶(4)YmRNA蛋白质课堂小结：网络构建核心回扣1.在进行体外培养时，必须模拟细胞在体内生存的良好环境和物质代谢过程，为其提供必需的营养物质、适宜的酸碱度、渗透压、温度、二氧化碳以及严格的无菌条件。2.细胞的培养过程分为原代培养和传代培养。3.体外培养的细胞生长特点是贴壁生长和接触抑制。4.应用细胞培养技术可生产生物制品，进行有毒物质和药物检测、人工皮肤的移植等。
