1、课题3血红蛋白的提取和分离1透析法分离蛋白质的目的是除去小分子杂质。2利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。3在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子的大小。5蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、纯化和纯度鉴定。6在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质分离的原理和方法自读教材夯基础1蛋白质分离的理论依据2分离的方法(1)凝胶色谱法：概念：也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。凝胶
2、原理：相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的时间较长；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。(2)电泳：概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。影响电泳速率的因素：方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。3缓冲溶液(1)作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。(2)配制：由12种缓冲剂溶解
3、于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。跟随名师解疑难1凝胶色谱法(1)凝胶：是一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道，具有多孔的凝胶，又称为分子筛。(2)原理：项目相对分子质量大相对分子质量小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被排阻在外面小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部运动方式垂直向下移动无规则扩散进入凝胶颗粒运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来2电泳的常用方法(1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。(2)聚丙
4、烯酰胺凝胶电泳：凝胶形成：加入SDS的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。特别提醒测定蛋白质相对分子质量通常用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定性强，可用检测仪直接测定。实 验 操 作自读教材夯基础1样品处理(1)红细胞的洗涤：目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。过程： (2)血红蛋白的释放：目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。过程： (3)分离血红蛋白溶液混合液离心用滤纸过滤除去脂溶性沉淀层分液漏斗
5、中静置片刻分离出下层红色透明液体。2粗分离透析(1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12 h。(2)目的：将相对分子质量较小的杂质除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。3纯化(1)通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。(2)过程：4纯度鉴定在鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。1洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。2在血红蛋白
6、释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？提示：加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂以释放血红蛋白。3血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。跟随名师解疑难1分离血红蛋白溶液的结果2样品处理、分离与纯化的目的不同操作目的红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析的杂质除去样品中相对分子质量较
7、小纯化除去相对分子质量较大的蛋白质3实验结果分析与评价(1)对血液样品处理后样品发生的变化：正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。(2)判断装填的凝胶色谱柱成功与否：方法(3)对分离效果的判断：若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。特别提醒洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一，如果样品出现浑浊
8、、有沉淀，可离心或过滤后再加样，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。凝胶电泳法原理分析例1 右图表示对某蛋白质溶液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(相似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述错误的是()A蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动B蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少C蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于相对分子质量的大小D电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种解析蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS聚丙
9、烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。答案B归纳拓展蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋白质分子的大小相关；在电场中的运动速度和方向除了与蛋白质的分子大小相关外，蛋白质的带电性质、电量、形状都影响其在电场中的运动方向和运动速度。凝胶色谱法的原理与操作例2 凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、
10、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_，原因是_。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_。(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是_。(5)若选用SephadexG75，则“G”表示_，75表示_。解析本题主要考查凝胶色谱法的原理和操作注意事项，可按以下思路进行分析作答。(1)原理：由于不同蛋白质其相对分子质量不同，相
11、对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。(2)注意事项：凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装填材料即交联葡聚糖凝胶的特点及表示方法。样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶所用液体均是物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，洗脱时，对洗脱液的流速要求保持稳定。答案(1)aa相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移
12、动速度较快(2)尼龙网和尼龙纱(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)相同保持稳定(5)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g归纳拓展 凝胶色谱操作注意事项分析 (1)实验结果如果不理想，需要重做时，必须进行凝胶色谱柱的重新装填。一般情况下，凝胶不会与其他溶质发生任何作用，因此，在一次分离以后，稍加平衡就可以进行下一次的操作。平衡时，需用3倍柱体积的洗脱液过柱。(2)如果实验操作中有一些杂质污染了色谱柱，可以用物质的量浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠和物质的量浓度为0.5 mol/L的氯化钠混合液处理交联葡聚糖凝胶。(3)如果凝胶长期
13、不用，可以加入抑菌剂低温保存，使用时再进行充分的平衡。随堂基础巩固1在使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为()解析：选B蛋白质相对分子质量越大，越容易通过凝胶间隙而先被洗脱出来 ，蛋白质相对分子质量越小越易进入凝胶内部而后被洗脱出来。2以下关于猪血红蛋白提纯的描述，错误的是()A洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢解析：选D相对分子质量越大的通过凝胶色谱柱的速度越快。3下列关于蛋白质的
14、提取与分离的叙述，正确的是()A在凝胶色谱柱内，分子质量较大的蛋白质路程较长，但移动速度较快B从凝胶色谱柱中最后分离出来的是分子质量较小的蛋白质C蛋白质的分离使用最多的方法是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法D分离血红蛋白溶液时，离心管的第三层是脂类物质解析：选B在凝胶色谱柱内，分子质量大的蛋白质不能进入凝胶内，路程短，移动速度快，而分子质量小的蛋白质会进入凝胶内，路程长，移动速度慢，最后洗脱出来的是分子质量较小的蛋白质；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法是蛋白质纯度鉴定使用最多的方法；分离血红蛋白溶液时，离心管中将出现四层，其中第三层就是血红蛋白溶液，而不是脂类物质。4下列关于电泳的说法，错误的是()A电泳
15、是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少D用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小解析：选C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。5红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的功能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2。血红蛋白可以从猪、牛、羊或其他脊椎动
16、物的血液中提取和分离。请回答下列有关问题：(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：_、_、_和_。(2)实验前取新鲜的血液，切记要在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_。以上所述的过程即是样品处理，它包括_、_、分离和收集血红蛋白溶液。(3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是_。透析的原理是_。(4)纯度鉴定时最常用的方法是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。样品纯化的目的是_。血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？_。解析：本题主要考查蛋白质提取和分离的相关知识，具体分析如下：答案
17、：(1)样品处理粗分离纯化纯度鉴定(2)防止血液的凝固红细胞的洗涤血红蛋白的释放(3)除去相对分子质量较小的杂质透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内(4)通过凝胶色谱法将相对分子质量与血红蛋白不同的杂质蛋白除去血红蛋白呈现红色在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断什么时期应该收集洗脱液；同时通过观察颜色使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作课时跟踪检测(满分50分时间25分钟)一、选择题(每小题3分，共24分)1下列有关“血红蛋白的提取和分离”的相关叙述中，正确的是()A用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面的杂蛋白B将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除
18、相对分子质量较大的杂质C血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂D血红蛋白的提取和分离一般分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定解析：选DA项是用生理盐水洗涤；B项中的血红蛋白质为大分子，透析的目的是为了除去小分子物质；C项的目的是使细胞破裂释放出血红蛋白。2下列说法错误的是()A在释放红细胞中的血红蛋白时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，充分搅拌10 min，红细胞破裂释放出血红蛋白B血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体C血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物D血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液解析：选B
19、血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为无色透明的甲苯层。3在蛋白质的提取和分离中，下列关于对样品处理过程的分析，无误的是()A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过低，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C洗涤过程选用0.1%的生理盐水D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质解析：选D洗涤红细胞的目的是去除血浆中的杂蛋白；洗涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的生理盐水。4细胞破碎后，各种蛋白质就会释放出来，再根据蛋白质的不同特性进行提取。下列关于蛋白质抽提的措施中，错误的是()A酸性蛋白质可用稀碱性溶液抽提B水溶
20、性蛋白质可用透析液(中性缓冲液)抽提C脂溶性蛋白质可用有机溶剂抽提D碱性蛋白质可用强酸性溶液抽提解析：选D抽提蛋白质的基本原理是根据蛋白质的理化性质，加入不同的试剂后，使蛋白质溶于试剂中而抽提蛋白质。强酸、强碱都会使蛋白质变性而沉淀。5以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理的叙述，正确的是()A红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水，重复洗涤3次B将血红蛋白溶液放在质量分数为0.9%的NaCl溶液中透析12 hC凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在D蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢解析：选C红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的生理盐水，重复洗涤3次目的是除去杂蛋白。透析时使用物质
21、的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，而不是用0.9%的NaCl溶液。蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的在凝胶外部移动，移动速度快。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。6取1 mL血红蛋白溶液装入透析袋中进行透析，下列相关说法错误的是()A透析液为300 mL 20 mmol/L的磷酸缓冲液B透析时间至少为12 h，时间过长血红蛋白也会渗漏出去C除去了相对分子质量较小的杂质，实现了样品的粗分离D透析也可用于更换样品的缓冲液解析：选B透析过程除去了相对分子质量较小的杂质，实现了粗分离过程，也用于更换样品的缓冲液；透析时烧杯中加入300 mL 2
22、0 mmol/L的磷酸缓冲液，透析时间为12 h，让小分子杂质与血红蛋白充分分离。7在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是()防止血红蛋白被氧气氧化血红蛋白是一种碱性物质，需要酸进行中和防止色谱柱内产生气泡，影响洗脱效果让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能ABCD解析：选D在血红蛋白的提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是防止色谱柱内产生气泡，影响洗脱效果，同时也为了让血红蛋白保持在体内所处的环境，以维持其结构和功能。8下图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述错误的是()A首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较大
23、的杂质B图乙装置的试管中收集到的液体中最先得到的是相对分子质量较大的蛋白质C用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集D图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动解析：选A用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。二、非选择题(共26分)9(10分)PCR技术可扩增DNA分子，电泳技术是将待测样品放在光滑的凝胶薄膜上，并加上直流电场，可利用分子带电荷不同分
24、离和分析氨基酸和多核苷酸片段等有机物。这两项技术综合应用于现代刑侦，可以获得最可靠的证据。下图是一次寻找嫌犯的测试结果：图甲是把遗迹中含有21个氨基酸的多肽进行水解，将氨基酸混合物进行电泳的结果；图乙是通过提取罪犯B遗迹DNA和四位嫌犯的DNA进行扩增，并采用特定限制酶处理后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱。(1)在同一电场下，由于蛋白质或DNA的_以及_、_不同而产生不同的迁移方向或速度，从而实现样品的分离。(2)由图甲得知，多肽由_种氨基酸组成；由图乙可知B最可能的对象是_。解析：(1)在同一电场下，由于各种分子的带电性质及分子本身大小、形状不同，而产生不同的迁移方向或速度，从而实现样品
25、中各种分子的分离。(2)不同种类氨基酸所带电荷不同，在电场力的作用下会做定向移动。同种氨基酸在匀强电场中的运动方向和移动距离相同，所以七条带则表明21个氨基酸的多肽分解形成7种氨基酸。同理，不同的DNA片段的带电荷的数量及链的长短不同，电泳时也可以将样品分成不同组分的条带，比较条带的异同程度，可以鉴别出罪犯为F2。答案：(1)带电性质本身大小形状(2)7F210(16分)红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2。我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。根据材料回答下列问题：(1)实验前取新鲜血液，要在采血
26、器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，立即进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_。(2)在对样品进行处理时，主要包括_、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。透析的原理是_。(3)同学乙利用凝胶色谱法进行血红蛋白的分离(如图1)，他在操作中加样的正确顺序是_。(4)图2、图3分别是同学甲、乙利用同一种样品分离得到的结果，则图3中与图2中蛋白质P对应的是_。解析：(1)加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。(2)对样品的处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析的原理是小分子可以自由通过透析袋(半透膜)，而大分子不能通过。(3)正确的加样顺序可依据样品在色谱柱及凝胶层中的渗入量进行分析，可以得出是。(4)SDS凝胶电泳装置是垂直的装置，此种电泳方法主要取决于蛋白质相对分子质量的大小，与电荷无关，同时加样在“”极，通电后，样品蛋白质向“”极移动，相对分子量小的，移动距离大，因此从图2的电泳结果分析，P比N、M移向“”距离大，说明P的相对分子质量比较小，因此洗脱出来的时间比较长，符合图3中的丙。答案：(1)防止血液凝固(2)红细胞的洗涤小分子可以自由通过透析袋(半透膜)，而大分子不能通过(3)(4)丙
