1、第1讲 基因工程课标导航5.1.1概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的5.1.2阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具5.1.3阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤5.1.4举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质5.2.1概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质5.2.2举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程1基因
2、工程的基本工具2基因工程的基本操作程序3蛋白质工程4DNA的粗提取与鉴定1实验原理2实验流程基础微点练清1判断正误(1)海鱼的抗冻蛋白基因是培育抗冻番茄的目的基因()新人教版选择性必修3 P83“概念检测”T1(1)(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来()(4)EcoliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端()(5)构建含有目的基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶()新人教版选择性必修3 P83“概念检测”T1(2)(6)利用乳腺生物反应器生产药物属于基因工程的应用新人教版选择性必修3 P92“概念检
3、测”T2B()(7)提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替()(8)在DNA的粗提取与鉴定实验中，用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同()2下列有关限制酶的叙述正确的是()A用限制酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个B限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大CCATG和GGATCC序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同D只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒解析：选B用限制酶切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需剪切2次，水解磷酸二酯键4个；限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大；CATG和
4、GGATCC序列被限制酶切出的黏性末端均有4个碱基；切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系，则两末端也可连接。3(新人教版选择性必修3 P74“概念检测”T1)DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( )A能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端解析：选CDNA连接酶的作用是连接末端互补的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键。4(
5、新人教版选择性必修3 P74“拓展应用”T1)想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？提示：生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。一、基因工程的操作工具试考题查欠缺1(2019全国卷)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括_和_。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双
6、链的酶是_。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的_。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_。解析：(1)基因工程中的基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，通过高温(9095 )使反应体系中的模板DNA解链为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合
7、酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。答案：(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至9095 氢键(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活2(2016全国卷)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)
8、所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)由题图可知，BamH和Sau3A两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因
9、均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有Ecoli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。答案：(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶强知能补欠缺1据图分析选择限制酶的两个依据选择依据内容根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲可选择Pst，不能选择Sm
10、a；为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)根据质粒的特点确定限制酶的种类切割质粒和目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；质粒上有标记基因等，所选限制酶尽量不要破坏这些结构。如图乙中选Sma会破坏标记基因；如果所选限制酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制2与DNA有关的酶的比较比较项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作
11、用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键形成产物黏性末端或平末端形成重组DNA分子新的DNA分子形成单链DNA3全面理解基因工程中的载体(1)应具备的条件能在受体细胞中复制并稳定保存，可使目的基因稳定存在且数量可扩大。具有一个至多个限制酶切点，可供外源DNA片段插入。具有标记基因，可供重组DNA的鉴定和选择。(2)与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。4载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力
12、。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：练题点全过关1根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有_和_。(2)质粒载体用EcoR切割后产生的片段如下：AATTCGGCTTAA为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_。(3)反转录作用的模板是_，产物是_。若要在体外获得大量反转录产物，常采用_技术。(4)基因工程中
13、除质粒外，_和_也可作为载体。解析：(1)当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。(2)为使载体与目的基因相连，不同的限制性核酸内切酶应该切出相同的黏性末端。(3)反转录是指以RNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA的过程，可以在体外短时间内大量扩增DNA的技术叫PCR(多聚酶链式反应)。(4)基因工程中可以作为载体的除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。答案：(1)黏性末端平末端(2)切割产生的DNA片段末端与EcoR切割产生的相同(3)mRNA(或RNA)cDNA(或
14、DNA)PCR(4)噬菌体的衍生物动植物病毒2(2020江苏高考)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤用的EcoR 是一种_酶，它通过识别特定的_切割特定位点。(2)步骤用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3羟基与5磷酸间形成_；PCR循环中，升温到95 是为了获得_；Taq DNA聚合酶的作用是催化_。(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤选用的PCR引物必须是_(从引物中选择，填编号)。DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物(4)对PCR产物
15、测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是_。A5AACTATGCGAGCCCTT3B5AATTCCATGCTGAATT3C5GCAATGCGTTCGGGAA3D5TTGATACGCCGAGTAC3解析：(1)根据题图可知，步骤是获取目的DNA片段，所用的酶EcoR 是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3羟基和5磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 是为了打开氢键使双链解旋，获得D
16、NA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5TCATGAGCGCATAGTT3(引物)和5 GCAATGCGTAGCCTCT3(引物)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR 切割后产生的黏性末端，因此其5端序列应为AATT,3端序列应为TTAA，B正确。答案：(1)限制性核酸内切(或限制)核苷酸序列(2)磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸(3)(4)B二、基
17、因工程的基本操作程序试考题查欠缺1(2021年1月新高考8省联考江苏卷)啤酒生产需经过制麦、糖化、发酵等主要环节。糖化主要是将麦芽中的淀粉等有机物水解为小分子的过程。主要工艺流程如下图所示，请回答下列问题：(1)大麦是啤酒发酵的重要碳源，针对制麦及糖化步骤，下列说法正确的有_(填序号)。大麦萌发时仅产生淀粉酶，几乎不产生蛋白酶用赤霉素处理大麦，可诱导淀粉酶的合成酵母不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等将淀粉转化成酵母可利用的糖糖化采用的温度越高，淀粉水解速度越快(2)啤酒发酵时具有活力的酵母需达到一定的数量，故在菌种活化的过程中，需定时取样，检测酵母的生长状况。若某次样品经2次10倍稀释后，经台盼蓝
18、染色(体积不计)，在2516型血细胞计数板上计数_色细胞，5个中格中的细胞数为244个，该样品中活酵母细胞的密度为_个细胞/mL。(3)敲除酿酒酵母中的蛋白酶基因，减少发酵液中蛋白的水解，有助于增强啤酒泡沫的稳定性，从而改善啤酒的品质。以下是某科研小组的实验：已知编码酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列如下(为非模板链)：编码该酶的mRNA，起始端的三个密码子依次为_，终止密码子为_。Cas9蛋白可在人为设定的RNA序列(sgRNA)引导下，在选定位点切断相应的DNA链(如下图)，在DNA自我连接的修复过程中产生突变。DNA序列中含NGG的位点具有较高的编辑效率(N为任意碱基)。上述PEP4序列
19、虚线框中有_处可作为Cas9的优选剪切位点。Cas9的剪切位点在其NGG识别位点的_(填“5”或“3”)侧。用酪蛋白固体培养基筛选突变体，野生型可以水解酪蛋白，在菌落周围形成透明圈。需要筛选透明圈_的菌落，表明其蛋白酶活性_。解析：(1)大麦萌发时会产生淀粉酶、蛋白酶等，错误；赤霉素处理大麦，可诱导淀粉酶的合成，促进种子萌发，正确；酵母细胞呼吸的底物为葡萄糖，不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等将淀粉转化成酵母可利用的糖，正确；酶的催化需要适宜的温度，糖化采用的温度过高，会影响酶的活性，使淀粉水解速度变慢，错误。(2)细胞膜具有选择透过性，台盼蓝不能进入活细胞，染色后用血细胞计数板计数时应对无色细胞
20、进行计数，若某次样品经2次10倍稀释后，在2516型血细胞计数板上计数，5个中格中的细胞数为244个，则该样品中活酵母细胞的密度为2445250.11021031.22109个/mL。(3)已知编码酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列为(为非模板链)：5ATGTTCAGCTTCAAAGCATTATTGCCATTGGCCTTGTTGTGGTGAGCGCCCAATTTGA3，模板链与非模板链方向相反，RNA 5端为起始端，起始端的三个密码子依次为AUG、UUC、AGC，终止密码子为UGA。DNA序列中含NGG的位点具有较高的编辑效率(N为任意碱基)。根据PEP4序列虚线框中的碱基序列，有4处可作为C
21、as9的优选剪切位点。据图可知，Cas9的剪切位点在其NGG识别位点的3侧。敲除酿酒酵母中的蛋白酶基因，减少发酵液中蛋白的水解，有助于增强啤酒泡沫的稳定性，从而改善啤酒的品质。用酪蛋白固体培养基筛选突变体，野生型可以水解酪蛋白，在菌落周围形成透明圈。因此需要筛选透明圈较小的菌落，表明其蛋白酶活性较低。答案：(1)(2)无1.22109(3)AUC、UUC、ACCUGA43小较低2(2018天津高考)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模
22、板，逆转录成对应DNA后，利用_技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的_，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与_连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的_进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导
23、入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加_的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是_(单选)。A病毒的DNA聚合酶B宿主的DNA聚合酶C病毒的RNA聚合酶 D宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起_免疫，增强免疫保护效果。解析：(1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序
24、列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术，鉴定筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。(4)不具有感染性的灭活病毒不能进入人体
25、细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。答案：(1)PCR多肽(或蛋白质)(2)载体总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)细胞3(2018江苏高考有改动)为生产具有特定性能的淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：(1)利用PCR技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的_。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_。
26、(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_的设定与引物有关，_的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度退火温度延伸温度变性时间退火时间延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：图中虚线框内mRNA片段包含_个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有_种。(5)获得工程菌表达的淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：缓冲液50 mmol/LNa2HPO4KH2PO450 mmol/LTrisHCl50 mmol/LGlyNaOHpH6.06.57.07.57.
27、58.08.59.09.09.510.010.5酶相对活性%25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根据上述实验结果，初步判断该淀粉酶活性最高的条件为_。解析：(1)利用PCR技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接
28、。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，34 kb的延伸时间为34 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不
29、是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16313(种)可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl。答案：(1)基因组DNA(2)5使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连(3)(4)813(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl强知能补欠缺1获取目的基因的方法(1)几种获取目的基因方法的比较(2)诠释PCR技术PCR原理：DNA复制原理，即：PCR反应过程过程说明图解变性温度上升到90 左右，双链DNA解聚为单链复性温度下降到55 左右，
30、两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸温度上升到72 左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5端向3端延伸结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。2基因表达载体的组成目的基因能够控制特定性状启动子RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录终止子RNA聚合酶脱离部位，终止转录标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到T
31、i质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞染色体的DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子4目的基因检测与鉴定的方法练题点全过关1为生产高效价疫苗和简化计划免疫程序，科学家研制出基因工程乙肝百白破(rHBDTP)四联疫苗，经各项检测均符合rHBDTP四联疫苗制检规程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳杆菌、白喉杆菌和破伤风杆菌的四种类毒素。请分析回答下列问题：(1)为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应_，在逆转录酶的作
32、用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列_(填“相同”或“不同”)。(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用_，然后通过_大量扩增，此技术的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。(3)把目的基因导入受体细胞时，科学家采用了改造后的腺病毒作为载体，写出选它的理由：_(写出2点)。(4)研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程：_。(5)实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的_数量增多，当同种抗原再次侵入人体时会引发二次免疫，
33、二次免疫的特点是_，免疫预防作用更强。解析：(1)为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应mRNA，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列不同。(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用化学方法人工合成，然后通过PCR技术大量扩增。(3)改造后的腺病毒有多个限制酶切割位点、有标记基因，且能自主复制，因此可作为载体将目的基因导入受体细胞。(4)将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸利用的是蛋白质工程的原理，基本流程：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相
34、对应的脱氧核苷酸序列。(5)实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的记忆细胞数量增多，当同种抗原再次侵入人体时会引发二次免疫，二次免疫的特点是短时间内迅速产生大量的抗体和记忆细胞，免疫预防作用更强。答案：(1)mRNA不同(2)化学方法人工合成PCR技术(3)能自主复制；有多个限制酶切割位点、有标记基因(4)从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)(5)记忆细胞短时间内迅速产生大量的抗体和记忆细胞2(2020北京高考)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌)，从
35、中克隆得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。(1)纤维素属于_糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是_。(2)对克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列相同，这是因为_。(3)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为53。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma和BamH的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是_
36、。(4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果(图2)说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为_。(5)预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用。(举一例)解析：(1)纤维素是由葡萄糖聚合形成的多糖，所以纤维素经过酶的催化作用可降解为葡萄糖。(2)一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性。由于密码子具有简并性，即使克隆得到的C1酶基因序列与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列仍相同。(3)根据题干信息，
37、C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为53，根据质粒上启动子的方向可判断酶切位点1对应的酶为BamH，而酶切位点2对应的酶为Sma。(4)比较图2中三组的实验结果可知，工程菌降解纤维素的能力最强，对照组2次之，对照组1中纤维素含量最高，由此判断，对照组2接种了降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌(B菌)。(5)该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以用该工程菌降解秸秆，以减少秸秆燃烧带来的环境污染。答案：(1)多葡萄糖(2)密码子具有简并性(3)BamH、Sma (顺序不能调换)(4)接种降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌(B菌)(5)降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的环境污染。三、基因
38、工程的应用与蛋白质工程试考题查欠缺1(2018全国卷)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2参与的_方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_的大
39、肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制
40、剂。答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶2(2019海南高考)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取_作为模板，在_催化下合成cDNA，再利用_技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的_中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细
41、胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_。(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是_。解析：(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要将Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质
42、粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。答案：(1)mRNA逆转录酶PCR(2)TDNA整合到叶肉细胞染色体DNA上(3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替
43、换为氨基酸乙的碱基3(2020山东等级考)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是_，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列_(填“发生”或“不发生”)改变，原因是_。(3)为
44、检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是_。(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_，原因是_。解析：(1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是
45、指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录(或反转录)，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故
46、通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，3个突变品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶转化(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合不发生编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子(3)逆转录(或反转录)引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)(4)品系3品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强强知能补欠缺1基因工程的应用(1)动物基
47、因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。(3)比较基因治疗与基因诊断原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用2蛋白质工程(1)流程图(2)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。(3)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。3蛋白质工程与基因工程的关系蛋白
48、质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造练题点全过关1(2021呼和浩特模拟)通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质。下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所
49、用的基因“手术刀”能识别的序列和切点是，请回答下列问题：(1)从羊染色体中“切下”羊蛋白质基因的酶是_，人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是_等。(2)请写出质粒被切割形成黏性末端的过程。(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是_，“插入”时用的工具是_，其种类有_等。解析：(1)限制酶可以识别并切割特定的脱氧核苷酸序列，可用于从羊染色体中“切下”羊蛋白质基因。“切下”的羊蛋白质基因，使用DNA连接酶将其与载体缝合，然后“插入”到羊的染色体中。 (2)图示的限制酶识别的序列为GGATCC，并且在G与G之间切开，因此形成的黏性末端为反向重复的，其过程见答案
50、。(3)羊的染色体的主要成分是DNA和蛋白质，其中DNA上的基因与人体蛋白质基因的结构是相同的，因此人体蛋白质基因能“插入”到羊的染色体内。“插入”时用的工具是载体，其种类有质粒、动植物病毒、噬菌体的衍生物等。答案：(1)限制酶DNA连接酶(2)(3)基因的结构相同载体质粒、动植物病毒、噬菌体的衍生物2(2019江苏高考)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题：(1)EcoR 酶切位点为，EcoR 酶切出来的线性载体P1为_末端。(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各
51、自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为_的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在_酶作用下，形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“”代表生长，“”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是_(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_、_。平板类型ABC无抗生素氨苄青霉素四环素氨苄青霉素四环素(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一
52、对引物是_。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_。解析：(1)从图中可以看出，EcoR 酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，形成P2，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P2连接起来。(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，
53、说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，则无论目的基因是否插入正确，都能通过PCR扩增大量目的基因，如果用乙、丙作为引物，当目的基因插入不正确(反向插入)时，则乙、丙两引物都结合在外侧，PCR不能正常进行，无法进行扩增鉴定，因此只能选用乙、丙作为引物，通过PCR鉴定目的基因是否插入正确。若扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。答案：(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA连接(3)BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒(4)乙、丙目的基因反向连接四、DN
54、A的粗提取与鉴定试考题查欠缺1(2020海南高考)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()A羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料B提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐C预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解D在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色解析：选A羊是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，因此羊的成熟红细胞不能作为提取DNA的材料，A错误；提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是溶解细胞膜，而食盐的作用是溶解DNA，B正确；冷却的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，C正确；在沸水浴条件下，DNA与二
55、苯胺反应呈现蓝色，D正确。2(2019江苏高考)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是()A用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近BDNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNAD用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热解析：选A哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和细胞器，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；DNA析出过程中，搅拌要轻柔且沿着一个方向，以防止DNA断裂，B正确；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C正确；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂
56、，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D正确。强知能补欠缺1DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异比较项目DNA蛋白质溶解性2 mol/L NaCl溶液中溶解析出0.14 mol/L NaCl溶液中析出溶解酒精溶液中析出溶解耐受性蛋白酶无影响水解高温80 以上变性不能忍受6080 的高温2DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、3、4”加蒸馏水2次加到鸡血细胞液中，使血细胞吸收水破裂；加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出用纱布过滤3次过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DN
57、A(黏稠物)；过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA3DNA粗提取实验中的三个注意点(1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。(2)因DNA容易被玻璃容器吸附，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，减少提取过程中DNA的损失。(3)每次用玻璃棒搅拌时都要沿同一方向，防止打碎DNA分子。练题点全过关1关于还原糖、蛋白质和D
58、NA的鉴定实验，下列叙述正确的是()A在甘蔗茎的组织样液中加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色B在大豆种子匀浆液中加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色C提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤液D将DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后液体由无色变成蓝色解析：选D甘蔗茎的组织样液富含蔗糖，而蔗糖属于非还原糖，且不能用斐林试剂检测，A错误；大豆种子中富含蛋白质，先后加入双缩脲试剂A液和B液摇匀后，液体由蓝色变为紫色，B错误；提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤纸上的黏稠物，留下滤液，C错误
59、；将DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂并水浴加热，溶液由无色变为蓝色，D正确。2在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，对DNA进行鉴定时，做如下操作：步骤AB1加2 mol/L的NaCl溶液5 mL加2 mol/L的NaCl溶液5 mL2不加加入提取的DNA丝状物并搅拌步骤AB3加4 mL二苯胺，混匀加4 mL二苯胺，混匀4沸水浴5 min沸水浴5 min实验现象实验结论(1)根据如图，完成表格空白处的实验内容。(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液的颜色为_。(3)在沸水浴中加热的目的是_，同时说明DNA对高温有较强的_。 (4)A试管在实验中的作用是_。 (5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与_有关。 答案：(1)溶液不变蓝色溶液变蓝色DNA在沸水浴的条件下遇二苯胺会变成蓝色(2)基本不变(不呈蓝色)(3)加快颜色反应速度耐受性(4)对照(5)DNA(丝状物)的多少
