1、基因工程的基本操作程序基因工程 The basic operating procedures of genetic engineeringy从社会中来 From society普通棉花转基因抗虫棉将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花 我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？从社会中来 From society培育转基因抗虫棉的简要过程 苏云金杆菌普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入与载体拼接重组DNA分子（核心）Bt基因基因通常是有遗传效应的DNA片段 A gene i
2、s usually a piece of DNA that has a genetic effectDNA片段基因1 基因2 基因3放大非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。基因通常是有遗传效应的DNA片段原核细胞的基因结构A gene is usually a piece of DNA that has a genetic effectGene structure of prokaryotic cells非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子
3、 终止子 连续的、不间隔的 RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子本质：位置：作用：是一段有特殊序列结构的DNA片段位于基因上游基因通常是有遗传效应的DNA片段原核细胞的基因结构A gene is usually a piece of DNA that has a genetic effectGene structure of prokaryotic cells非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 连续的、不间隔的 终止子本质：位置：作用：也是一段有特殊序列结构的DNA片段位于基因下游终止转录基因通常是有遗传效应的DNA片段真核细胞的基因结构A
4、 gene is usually a piece of DNA that has a genetic effectGene structure of eukaryotic cells非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 间隔的、不连续的 内含子 外显子 外显子：内含子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。基因通常是有遗传效应的DNA片段真核细胞的基因结构 A gene is usually a piece of DNA that has a genetic effect Gene struct
5、ure of eukaryotic cells真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时是否转录？启动子 终止子 内含子 外显子 转录 初级RNA成熟mRNA剪切、拼接基因通常是有遗传效应的DNA片段 A gene is usually a piece of DNA that has a genetic effect原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、的 相同点 都有能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 非编码序列=非编码区 原核基因：非编码序列 真核基因：=非编码区+内含子 目 录 目的基因的筛选与获取 Screening
6、 and acquisition of target genes0 1基因表达载体的构建Construction of gene expression vector0 2Detection and identification of target genes目的基因的检测与鉴定0 4将目的基因导入受体细胞 Introduce the target gene into the recipient cell0 3Exercises to consolidate习题巩固0 5目的基因的筛选与获取Screening and acquisition of target genes第一部分 目的基因的筛选
7、与获取 Screening and acquisition of target genes一、目的基因概念在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。目的基因的筛选与获取 Screening and acquisition of target genes当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。1.Bt抗虫蛋白的抗
8、虫原理？2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。目的基因的筛选与获取Screening and acquisition of target genes苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。目的基因的筛选与获取 Screening and acquisition of target
9、 genes二、筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。认识基因结构和功能的技术方法随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。目的基因的筛选与获取 Screening and acquisition of target genes测序技术序列数据库(如GenBank)序列比对工具(如BLAST)测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过
10、比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。目的基因的筛选与获取 Screening and acquisition of target genes三、目的基因的获取方法3.利用PCR获取和扩增目的基因1.从基因文库中获取2.通过DNA合成仪直接合成从基因文库中直接获取基因文库的构建过程将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。目的基因的筛选与获取从基因文库中直接获取 Screening and acquisition of target genesDirectly from the gene library基因文库类型基
11、因组文库部分基因文库（主要是cDNA文库）（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许 多DNA片段该生物基因组文库每个受体菌含有一段不同的DNA片段与载体连接导入受体菌群含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。目的基因的筛选与获取从基因文库中直接获取 Screening and acquisition of target genesDirectly from the gene library含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。（2）cDNA文库的构建mRNA逆转录形成mRNA 杂交双链 单链DNA双链cDNA(cDNA)该生物cDNA文库基因组文库中的基因
12、含有启动子、终止子、内含子，cDNA文库中的基因不含以上结构。与载体连接导入受体菌群逆转录酶核酸酶HDNA聚合酶某一发育时期基因组文库从细胞中提取DNA细胞基因组DNA质粒质粒酶切DNA连接酶连接限制酶酶切导入细菌中基因组文库克隆提取酶切的DNA片段cDNA文库逆转录逆转录酶酶切的cDNA片段限制酶酶切质粒质粒酶切连接导入细菌中cDNA文库克隆提取目的基因的筛选与获取从基因文库中直接获取 Screening and acquisition of target genesDirectly from the gene library文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因
13、多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以目的基因的筛选与获取从基因文库中直接获取 Screening and acquisition of target genesDirectly from the gene library1.下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是()A.cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，基因组文库中含有某种生物的全部基因B.如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同C.cDNA文库中的基因没有启动子D.一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基
14、因组文库只有一种B目的基因的筛选与获取 Screening and acquisition of target genes通过DNA合成仪直接合成（1）前提：（2）方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因目的基因的筛选与获取通过DNA合成仪直接合成Screening and acquisition of target genesDirectly synthesized by DNA synthesizer目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成反转录法：根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构
15、基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成目的基因的筛选与获取 Screening and acquisition of target genes利用PCR获取和扩增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR是一项根据的原理，在提供参与DNA复制的与，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA半保留复制体外各种组分反应条件PCR聚合酶链式反应1.PCR的原理：DNA半保留复制目的基因的筛选与获取体内DNA复制过程Screening and acquisition of target genesDNA replication in the b
16、ody解旋：在ATP的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开。CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3 5 CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3 5 ATP 解旋酶 目的基因的筛选与获取体内DNA复制过程Screening and acquisition of target genesDNA replication in the body定序：游离的脱氧核苷酸按碱基互补配对原则随机地与两条母链的碱基配对，确定子链的脱氧核苷酸排列顺序。CCGT
17、AGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3 5 ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT形成氢键目的基因的筛选与获取体内DNA复制过程Screening and acquisition of target genesDNA replication in the body合成子链：在DNA聚合酶的催化下从子链的5端把子链的脱氧核苷酸聚合成脱氧核苷酸链。CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3 5 ACGCAAGCTAGTCATTAT
18、ATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5 3 TATGCATGATCGAGCTT5 3 ATPATP合成方向：子链的5端 3端形成磷酸二酯键目的基因的筛选与获取体内DNA复制过程Screening and acquisition of target genesDNA replication in the body形成子代DNA分子：每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3 5 ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCT
19、T5 3 TAGCCGTATAGCCGATAT3 5 TTACGCGTATATATA5 3 目的基因的筛选与获取体内DNA复制所需的基本条件Screening and acquisition of target genesThe basic conditions for DNA replication in the body参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因Screening and a
20、cquisition of target genesThe target gene was obtained and amplified by PCR35子链的延伸方向是5 3 DNA聚合酶35模板链子链DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3端子链合成需要引物:引物为DNA聚合酶提供了游离的3 端，使DNA聚合酶从3 端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)目的基因的筛选与获取引物Screening and acquisition of target genesprimer引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为2030个核苷酸。在细
21、胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。什么是引物子链延伸子链延伸引物是决定PCR特异性的关键。-5 3 -引物5 -3 5 -3 引物3 -5 目的基因的筛选与获取体外PCR所需的基本条件Screening and acquisition of target genesBasic requirements for in vitro PCR耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTP目的基因的筛选与获取腺苷三磷酸 Screening and
22、acquisition of target genesAdenosine triphosphate 腺嘌呤 核糖 PPP腺苷三磷酸（ATP）A-PPP腺嘌呤核糖核苷酸(AMP）腺苷二磷酸（ADP）腺苷（A)OHOH目的基因的筛选与获取脱氧核苷三磷酸 Screening and acquisition of target genesDeoxynucleoside triphosphatedATP腺嘌呤脱氧核苷酸dADP腺苷（A)腺嘌呤 脱氧核糖 PPPOHH在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。目
23、的基因的筛选与获取体外PCR所需的基本条件Screening and acquisition of target genesBasic requirements for in vitro PCR参与的组分在PCR的作用目的基因DNA4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)引物缓冲液Mg2+高温使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链维持反应体系的pH激活DNA聚合酶的活性目的基因的筛选与获取PCR的过程Screening and acquisition of target genesThe process o
24、f PCRDNA解链为单链引物结合到互补DNA链Taq酶从引物起始进行子链的合成PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。目的基因的筛选与获取PCR的过程Screening and acquisition of target genesThe process of PCR第1步：变性5-3-3-5 5-3-3-5 当温度超过90时，双链DNA解旋为单链。95目的基因的筛选与获取PCR的过程Screening and acquisition of target genesThe process of PCR5-3-3-5 5-3-5 3-第2步：复性当温度下降到50左右时，两种引物通过碱
25、基互补配对与两条单链DNA结合。50长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高目的基因的筛选与获取PCR的过程Screening and acquisition of target genesThe process of PCR思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。原因是：模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。目的基因的筛选与获取PCR的过程Screening
26、 and acquisition of target genesThe process of PCR5-3-5 3-第3步：延伸5-3-5 3-5-3-5 3-当温度上升到72左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。72目的基因的筛选与获取PCR的过程Screening and acquisition of target genesThe process of PCR第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。5-33-53-55-35-33-55-33-55-33-55-33-5第二轮循环的产物作
27、为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。533553355335533553355335533553355335533553355335聚合酶链式反应过程归纳Polymerase chain reactionThe process of induction目的基因DNA_后_，_与单链相应互补序列结合；然后以_为模板在作用下进行_，即将4种_加到_，如此重复循环多次。受热变性解为单链引物延伸单链DNA耐高温的DNA聚合酶引物的3 端脱氧核苷酸每次循环一般可以分为_、_、_三步。变性复性延伸变性：加热至90以上，_;复性：冷却至左右，引物与单链DNA结合；延伸：加热至72左
28、右，从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。双链DNA解聚为单链50耐高温的DNA聚合酶聚合酶链式反应过程归纳Polymerase chain reactionThe process of induction利用PCR获取和扩增目的基因条件_：DNA的两条链。_：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。原料：A、T、G、C四种_。酶：酶。其他条件：需要一定的溶液和能严格控制温度的温控设备。模板引物脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合缓冲由于延伸后得到的_又可以作为下一个循环的_，因而每一次循环后目的基因的量可以增加_，即呈_形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。产物模板一倍指
29、数比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化边解旋边复制场所主要在细胞核内酶解旋酶、DNA聚合酶等温度细胞内温和条件结果合成整个DNA分子联系模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板原料:均为四种脱氧核苷酸酶:均需DNA聚合酶引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3端合成子链DNA在高温下变性解旋全部解旋后再复制细胞外(主要在PCR扩增仪内)耐高温的DNA聚合酶控制温度，需在不同温度下进行扩增特定的DNA片段或基因聚合酶链式反应Polymerase chain reaction思考:用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。mRNA 杂交
30、双链 单链DNA双链cDNA逆转录酶核酸酶HDNA聚合酶RNA链DNA链聚合酶链式反应扩增产物的鉴定Polymerase chain reactionIdentification of amplified products常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。目的基因的筛选与获取Screening and acquisition of target genes1.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的
31、最方便方法是（）A.化学合成法B.基因组文库法C.cDNA文库法D.聚合酶式链反应2.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（）从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因逆转录法通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B CDDD目的基因的筛选与获取Screening and acquisition of target genes3.下列有关PCR技术的说法，不正确的是()APCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术BPCR技术的原理是DNA双链复制C利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列DPCR扩增中需要解旋酶解开双链DNAD拓展应用PCR
32、相关计算Their applicationPCR correlation calculation长链-中长链DNA_个含有引物A的DNA_个含有引物B的DNA_个211第一次扩增引物A 引物B 拓展应用PCR相关计算Their applicationPCR correlation calculation中长链-短链DNA_个2长链-中长链DNA_个含有引物A的DNA_个含有引物B的DNA_个233第二次扩增拓展应用PCR相关计算Their applicationPCR correlation calculation第三次扩增中长链-短链DNA_个4长链-中长链DNA_个含有引物A的DNA_个含
33、有引物B的DNA_个277短链-短链DNA_个2拓展应用PCR相关计算Their applicationPCR correlation calculation第四次扩增中长链-短链DNA_个6长链-中长链DNA_个含有引物A的DNA_个含有引物B的DNA_个21515短链-短链DNA_个8拓展应用PCR扩增DNA规律Their applicationRule of PCR amplification of DNA扩增次数第1次第2次第3次第4次第n次DNA总数212223242n长链-中长链DNA中长链-短链DNA短链-短链DNA含引物A(或B)的DNA22(n-1)2n-2n2n-1聚合酶链
34、式反应过程归纳Polymerase chain reactionThe process of induction一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：子代DNA分子数为：_个子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：_个子代含有的目的基因数目：_个子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：_个复制过程中共需引物_个第n次复制需要引物_个2n22n-12n1-22n2n-2nPCR扩增DNA规律拓展应用PCR相关计算Their applicationPCR correlation calculation1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地
35、拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第种DNA分子有()A.8个B.6个C.4个D.2个A拓展应用PCR相关计算Their applicationPCR correlation calculation图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为_。15/162.利用PCR技术扩增目的基本因，其原理与细胞内DNA复制类似。拓展应用PCR引
36、物的设计Their applicationDesign of PCR primers设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增高效性。1.引物设计需考虑的两个因素扩增特异性扩增高效性引物特异性：只扩增出目标DNA的特性高效性：单位时间内扩增产物的量特异性太强，扩增效率就会下降提高扩增效率，扩增特异性就会下降拓展应用PCR引物的设计Their applicationDesign of PCR primers2.引物设计的原则引物长度一般在15-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。引物G-C含量一般在40%60%之间，G-C含量过高或过低都不
37、利于引发反应。拓展应用PCR引物的设计Their applicationDesign of PCR primers引物自身及引物之间不应存在互补序列碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。拓展应用PCR引物的设计Their applicationDesign of PCR primers复性温度复性温度高，扩增特异性强，复性温度低，扩增效率高。如果引物碱基数较少，可以适当提高复性温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低复性温度，使DNA双链结合。一对引物的复性温度相差
38、46不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的复性温度是一样的。拓展应用PCR引物的设计Their applicationDesign of PCR primers引物的5端可以修饰，而3端不可修饰引物的5 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。拓展应用PCR引物的设计Their applicationDesign of PCR primers引物长度要适宜引物G-C含量要适宜
39、引物自身及引物之间不应存在互补序列引物5端可以修饰，3端不可修饰复性温度要适宜设计的目的是在两个目标间取得平衡:扩增特异性和高效性。基因表达载体的构建Construction of gene expression vector第二部分 基因表达载体的构建Construction of gene expression vector获得目的基因后直接转入受体吗？不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。1.基因表达载体的作用使目的基因在受体细
40、胞中稳定存在且遗传给下一代;使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用。质粒 基因表达载体的构建Construction of gene expression vector2.基因表达载体的组成标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。供目的基因插入载体中便于重组DNA的筛选能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上基因表达载体的构建注意事项Construction of gene expression vectorMatters needing atte
41、ntion(1)基因工程中的基因表达载体载体：基因表达载体与载体相比增加了。目的基因(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 诱导型启动子：基因表达载体的构建Construction of gene expression vector 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学 成分 位置 作用 DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基目的基因首端 目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA
42、聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束基因表达载体的构建Construction of gene expression vector3.基因表达载体构建的流程同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割DNA连接酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因限制酶切割位点质粒重组DNA分子限制酶限制酶基因表达载体的构建Construction of gene expression vector限制酶限制酶DNA连接酶质粒重组DNA分子目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。思考分析单酶切的缺点 Thinking analysisDis
43、advantages of single enzyme digestion用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段重组质粒a bcda、b、c、d四个黏性末端相同。限制酶切割DNA连接酶连接启动子方向目的基因转录方向思考分析单酶切的缺点 Thinking analysisDisadvantages of single enzyme digestion缺点1：在DNA连接酶的作用下，质粒自身环化。a bcd限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接思考分析单酶切的缺点 Thinking analysisDisadvantages of single enzy
44、me digestion缺点2：在DNA连接酶的作用，目的基因自身环化。a bcd限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接思考分析单酶切的缺点 Thinking analysisDisadvantages of single enzyme digestiona bcd限制酶切割DNA连接酶连接反向连接重组DNA缺点3：在DNA连接酶的作用，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。思考分析单酶切的缺点 Thinking analysisDisadvantages of single enzyme digestiona bcd限制酶切割DNA连接酶连接缺点1缺点2缺点3反向连接重组DN
45、A质粒自身环化目的基因自身环化思考分析双酶切 Thinking analysisDouble enzyme用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段重组质粒限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd黏性末端a与相同；黏性末端b与d相同。思考分析双酶切 Thinking analysisDouble enzyme限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd质粒不会重新环化目的基因不会被环化优点1优点2优点3 目的基因与质粒不会发生反向连接确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。习题巩固用限制酶切割时需注意的事项Exercises
46、to consolidatePoints needing attention when cutting with restriction enzyme(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是为了。但是使用该法缺点是容易发生以及，为了避免上述情况发生，可采取的措施是。产生相同的黏性末端，便于连接目的基因与质粒反向连接目的基因、质粒的自身环化分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体(2)获取一个目的基因需限制酶切割次,共产生个游离的磷酸基团。两4习题巩固用限制酶切割时需注意的事项Exercises to consolidatePoints needing attention wh
47、en cutting with restriction enzyme(3)选择限制酶切割位点的基本原则：切割目的基因时：。切割质粒时：。能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选基因表达载体的构建Construction of gene expression vector1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是()A.二者子链的延伸方向相同，均为5端3端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同B基因表达载体的构建Construction of gene expression
48、 vector2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是()A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A将目的基因导入受体细胞Introduce the target gene into the recipient cell第三部分 将目的基因导入受体细胞Introduce the target gene into the recipient cell常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
49、酵母菌和动植物细胞等。方法植物细胞：动物细胞：微生物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法(感受态细胞法)由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。将目的基因导入受体细胞植物细胞Introduce the target gene into the recipient cellPlant cell1.花粉管通道法我国科学家独创的一种方法。可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。将目的基因导入
50、受体细胞花粉管通道法Introduce the target gene into the recipient cellPollen tube passage method优点利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。受体细胞：受精卵 将目的基因导入受体细胞植物细胞Introduce the target gene into the recipient cellPlant cell2.农杆菌转化法农杆菌是一种在土壤
51、中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的DNA上。采用最多将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法Introduce the target gene into the recipient cellAgrobacterium transformation method转化 目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程。受体细胞 稳定 表达 此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化
52、”含义相同，实质都是基因重组。方法将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。受体细胞为_ 体细胞 受体细胞为_ 受精卵 将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法Introduce the target gene into the recipient cellAgrobacterium transformation methodTi质粒目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物将目的基因插入染色体DNA中植物细胞将
53、目的基因导入受体细胞农杆菌转化法Introduce the target gene into the recipient cellAgrobacterium transformation method_插入Ti质粒的_中形成重组Ti质粒重组Ti质粒转入_转化植物细胞目的基因插入植物细胞中的_上目的基因在植物细胞中稳定存在并_表达目的基因T-DNA农杆菌染色体DNA将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法Introduce the target gene into the recipient cellAgrobacterium transformation method两次拼接第一次拼接：目的基因拼接
54、到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法Introduce the target gene into the recipient cellAgrobacterium transformation method两次导入第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。将目的基因导入受体细胞植物细胞Introduce the target gene into the recipient cellPlant cell3.基因枪法适用于单
55、子叶植物 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。将目的基因导入受体细胞动物细胞Introduce the target gene into the recipient cellAnimal cells显微注射法受精卵 注射器 固定吸管 显微注射仪 将含有目的基因的 表达裁体提纯 显微注射入动物的受精卵 受精卵发育 获得具有新性状的动物 受体细胞：受精卵 将目的基因导入受体细胞微生物细胞Introduce the target gene into the recipient cellMicrobial
56、 cell1.原核生物的作为受体细胞的优点繁殖快单细胞遗传物质少2.导入方法：Ca2+处理法(感受态细胞法)大肠杆菌感受态细胞Ca2+混合表达载体缓冲液溶于吸收DNA，完成转化使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。将目的基因导入受体细胞微生物细胞Introduce the target gene into the recipient cellMicrobial cell胰腺提取筛选胰岛素mRNA胰岛素cDNA逆转录重组质粒质粒导入大肠杆菌mRNA胰岛素原胰岛素加工用原核生物生产胰岛素示意图
57、注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌中导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上提纯含目的基因的表达载体显微注射受精卵发育具有新性状的个体Ca2处理细胞感受态细胞基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子将目的基因导入受体细胞Introduce the target gene into the recipient cell将生物的所有DNA直接导入
58、受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。将目的基因导入受体细胞Introduce the target gene into the recipient cell1.基因工程常用的受体细胞有（）大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞ABCDD2.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A.人工合成基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导
59、入受体细胞D.目的基因的检测和表达C将目的基因导入受体细胞Introduce the target gene into the recipient cell3.体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是()选项受体细胞导入方法A棉花细胞花粉管通道法B大肠杆菌农杆菌转化法C羊受精卵显微注射技术D小麦细胞基因枪法B目的基因的检测与鉴定Detection and identification of target genes第四部分 目的基因的检测与鉴定Detection and identification of target genes检查目的基因进入受体
60、细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。1.分子水平的检测检测目的基因是否导入方法1：PCR扩增转基因生物DNA作为模板是否扩增出目的基因PCR操作电泳操作非转基因棉花转基因抗虫棉阴性对照Marker目的基因的检测与鉴定分子水平的检测Detection and identification of target genesMolecular level detection方法2：DNA分子杂交技术碱基互补配对 原理：酶切转膜标记的DNA/RNA探针DNA分子杂交（Southern-blot)流程图原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。目的基因
61、的检测与鉴定DNA分子杂交法Detection and identification of target genesDNA molecular hybridization 首先取出转基因生物的基因组DNA。将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化剂）等作标记,以此做探针。使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。提取RNA转膜标记的DNA/RNA探针RNA目的基因的检测与鉴定分子水平的
62、检测Detection and identification of target genesMolecular level detection检测目的基因是否转录方法1：RT-PCR扩增转基因生物RNA作为模板PCR操作电泳是否扩增出目的基因逆转录cDNA方法2：DNA分子杂交技术RNA分子杂交(Northern Blot)流程图目的基因的检测与鉴定分子水平的检测Detection and identification of target genesMolecular level detection检测目的基因是否翻译 方法：抗原 抗体杂交技术苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记
63、抗体提取蛋白电泳分离杂交转基因生物放射性检测（杂交带）过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 是否出现杂交带目的基因的检测与鉴定Detection and identification of target genes2.个体水平的检测检测目的基因是否表现出相应的性状方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等棉铃虫 棉铃虫（死亡）目的基因的检测与鉴定Detection and identification of target genes类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂
64、交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等目的基因的检测与鉴定Detection and identification of target genes基因工程的基本操作程序The basic operating procedures of genetic engineering1.目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增化学方法人工合成2.构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞-关键花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、感受态细胞转化法(微生物);4.目的基因的检测与鉴定-保证分子检测：是否插入、转录、翻
65、译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。到社会中去Go out into the world1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。到社会中去Go out into the world2.科研工作者在没有发现棉铃虫
66、出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）轮作或套种等。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全生评价等。习题巩固Exercises to consolidate第五部分 习题巩固Exercises to consolidate1.研究人员将一种海鱼的
67、抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上,然后用它侵染番茄细胞,获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。(1)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（）(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（）(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因,就代表抗冻番茄培育成功。（）习题巩固Exercises to consolidate2.利用PCR既可以快速扩增特定基因,也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸
68、过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸D习题巩固Exercises to consolidate1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时,发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律,在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料,尝试对这个问题作出解释。外源基因插入基因组中可能为单位点插入,或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下,插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此,外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如,科研人员在对转GUS基因(-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达
69、分析时,发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外,外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。习题巩固Exercises to consolidate2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。习题巩固Exercises to consolidate（1）科学家在培育“黄金大米”
70、时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是，标记基因是，质粒pSYN 12424的作用是。ctrl 基因和psy基因Pmi基因将目的基因送入水稻细胞（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。习题巩固Exercises to consolidate（3）请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 黄金大米”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。习题巩固Exercises to consolidate关于“是否要推广黄金大米”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此,科学家将两个参与-胡萝卜素合成的酶的基因转人了籼稻中,使其胚乳中富含-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A,从而降低维生素A缺乏症的患病率。课时作业
