1、返回目录 DNA和蛋白质技术 专题5 返回目录 DNA和蛋白质技术 专题5 返回目录 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段返回目录 学习要求 1.理解PCR的基本原理。2.掌握PCR的基本操作过程。返回目录 课前 教材预案课堂 深度拓展课末 随堂演练课后 限时作业目录Contents 返回目录 1PCR扩增的原理及条件(1)概 念：PCR 即 _，是 一 种_迅速_的技术。它能以极少量的_为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。课前教材预案要点一 PCR技术的原理及反应过程多聚酶链式反应 体外 扩增DNA片段 DNA 返回目录(2)原理DNA的热变性：在_的温度范围内，DNA双螺旋结构解
2、体，双链分开，这个过程称为_。当温度缓慢_后，两条彼此分离的DNA链又会重新_。子链的合成：a.需要_；b合成方向总是从子链的_端向_端延伸。80100 变性 降低 结合成双链 引物 5 3 返回目录(3)条件_模板。分 别 与 模 板 DNA 两 条 模 板 链 相 结 合 的 两 种_。A、T、G、C四种_。DNA 引物 脱氧核苷酸 返回目录 耐 热 的 DNA 聚 合 酶，一 般 用 耐 高 温 的_。需要一定的_和能严格控制_的温控设备。Taq DNA聚合酶 缓冲溶液 温度 返回目录 2PCR的反应过程：PCR一般要经历_次 循 环，每 次 循 环 可 以 分 为 _、_ 和_三步。(
3、1)_：当温度上升到_以上时，双链DNA解聚为单链。(2)_：温 度 下 降 到 _ 左 右，_通过_与两条单链DNA结合。三十多 变性 复性 延伸 变性 90 复性 50 两种引物 碱基互补配对 返回目录(3)_：温度上升到_左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。延伸 72 DNA聚合酶 返回目录 1实验用具(1)PCR 仪：该 仪 器 能 自 动 调 控 _，实 现DNA 的 扩 增。如 果 没 有 PCR 仪，可 用 3 个_代替，操作时按程序在3个_中_PCR反应的微量离心管。要点二 PCR技术的实验操作及评价温度 恒温水浴锅 水浴锅 来回转移
4、 返回目录(2)微量离心管：总容积为_，实际上是进行_的场所。(3)微量移液器：用于_。2操作步骤准备_混合_反应。0.5 mL 多聚酶链式反应 转移PCR配方中的液体 加入组分 设置PCR的循环程序 返回目录 3操作提示(1)为避免_等因素的污染，实验中使用的一些用具、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行_。(2)所用的_和_应分装成小份，并在_储存。(3)在_中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须_。外源DNA 高压灭菌 缓冲液 酶 20 微量离心管 更换 返回目录 课堂深度拓展考点一 多聚酶链式反应(PCR)1PCR的反应过程返回目录(1)变性：当温度上升到90 以上时，双
5、链DNA解聚为单链，如下图所示。返回目录(2)复性：当系统温度下降至50 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图所示。返回目录(3)延伸：当系统温度上升至72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图所示。返回目录 2反应结果PCR过程经过三十多次变性、复性、延伸的循环，两个引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。返回目录 PCR扩增与DNA复制的比较项目PCR扩增DNA复制不同点场所在体外的反应缓冲液中进行在体内的活细胞内进行解旋方式高温变性解旋解旋酶解旋返回目录 项目PCR扩增DNA复制不同
6、点扩增过程完全解开再复制，分为变性、复性(或退火)和延伸三个步骤边解旋边复制引物DNA或RNARNA结果短时间内形成大量的DNA片段形成的是整个DNA分子返回目录 项目PCR扩增DNA复制相同点都需要：DNA模板、DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸等成分都遵循碱基互补配对原则，有解旋和延伸过程，子链延伸的方向都是从5端至3端都属于半保留复制结果都使DNA的量按2n呈指数式扩增返回目录【例题1】如图表示DNA的变性和复性，下列相关说法正确的是()A由左向右的过程表示热(80100)变性的过程B由右向左的过程为DNA双链迅速冷却复性C变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同D图中DNA片段共有4
7、个游离的磷酸基团、4个3端返回目录 思维导引：PCR与体内DNA复制有一定的差别，分为变性、复性、延伸三个阶段，复性过程要求温度缓慢降低至55 左右。答案 A 解析 变性后的DNA在缓慢降温后才会复性；变性与在生物体内解旋过程的条件不同、实质相同；任一DNA片段都有两个游离的磷酸基团(5端)和两个羟基(3端)。返回目录【变式1】DNA的复制需要引物，主要原因是()A可加快DNA的复制速度B引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C引物的5端有助于DNA聚合酶延伸DNA链DDNA聚合酶只能从3端延伸DNA链答案 D 返回目录 解析 DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DN
8、A的羟基(OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从5端开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。返回目录 1实验设计在PCR实验中，通常要用到微量离心管，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分。考点二 PCR的实验设计、结果分析与评价返回目录 2实验步骤(1)准备：按配方将所需试剂摆放在实验桌上。(2)移液：用微量移液器按配方向微量离心管中依次加入各组分。(
9、3)混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。返回目录(4)离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。(5)反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置好PCR仪的循环程序。返回目录 3结果分析与评价DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，以判断DNA片段的扩增是否成功，具体方法如下：(1)稀释：取2 L PCR反应液，加入98 L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。返回目录(2)对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外线分光光度计的读数调节至零。(3)测定：取步骤(1)中的DNA稀释液100 L至比色杯中，测定260 n
10、m处的光吸收值。(4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为DNA含量(L/mL)50(260 nm的读数)稀释倍数。返回目录 PCR产物的分析(1)PCR产物的种类：主要看其DNA片段上的引物种类。若只有一种引物，则是原始模板复制的产物，在每次循环中均有。若含有两种引物，则最早出现在第二次循环，以后每次循环中均有。返回目录(2)PCR产物的数量(以1个DNA分子经n次循环扩增的产物分析)。PCR产物的总数量：2n。PCR扩增的特异性片段的数量：2n2。返回目录【例题2】多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下
11、述30多次循环：95 下使模板DNA变性55 下复性(引物与DNA模板链结合)72 下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是()A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现返回目录 B复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高返回目录 思维导引：答案 C 返回目录 解析 变性中，95 破坏氢键，DNA解聚，此过程也可在解旋酶作用下完成，A项正确；复性中，55 下引物与DNA模板链依据碱基互补配对原则结合，B项正确；延
12、伸中，需要四种脱氧核苷酸，C项错误；PCR需耐高温的DNA聚合酶，D项正确。返回目录【变式2】近年来，PCR技术已成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。返回目录(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开_键，称为_。(2)当温度缓慢降低时，引物与模板_端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成 两 个 DNA 分 子。此 过 程 中，原 料 是_，遵循的原则是_。返回目录(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、酶以外，至少还需要三个，即液体环境、
13、适宜的_和_，前者由PCR仪自动调控，后者则靠_来维持。(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个15N标记的模板DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制三次后，则含15N标记的DNA链占全部DNA总单链数的比例为_。返回目录 解析(1)PCR技术中第一步是利用高温使DNA双链间的氢键断裂，称为变性。(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需要的原料一样，为四种脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。(3)PCR技术与细胞内DNA复制条件不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，还需要液体环境、适宜的温度和酸碱度。适宜的温度靠PCR仪自动调控，酸碱度靠缓冲
14、溶液来维持。返回目录(4)DNA的复制方式为半保留复制。一个DNA分子连续复制三次产生238个DNA分子，共16条单链。15N标记的DNA单链共有2条，所占比例为2/161/8。答案(1)氢 变性(2)3 4种脱氧核苷酸 碱基互补配对原则(3)温度 酸碱度 缓冲溶液(4)1/8返回目录 1PCR技术扩增DNA，需要的条件是()目的基因 引物 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 mRNA 核糖体A BC D课末随堂演练返回目录 答案 A 解析 PCR技术扩增DNA需要DNA模板(目的基因)、两种引物、四种脱氧核苷酸和耐热的DNA聚合酶等。返回目录 2下列对PCR的实验操作顺序的叙述，正确的是()
15、A准备移液混合离心反应B准备移液离心混合反应C离心移液混合反应D移液离心混合反应答案 A 返回目录 解析 PCR的实验操作中，首先是准备，即按照PCR反应体系的配方将需要的试剂摆放在实验桌上；其次是移液，即用微量移液器按照配方向微量离心管中依次加入各组分；然后是混合，即盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液混合均匀；接着是离心，即将微量离心管放在离心机上，离心约10 s；最后是反应。返回目录 3PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的分别是()95，使DNA分子变性，失去生物活性 95，使DNA分子变性，解开螺旋 55，使DNA分子开始复制、延伸 55，使DNA分
16、子的两条单链与引物结合，恢复活性 返回目录 72，使DNA分子开始复制、延伸 72，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性A BC D答案 C 返回目录 解析 PCR技术在温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链；当系统温度下降到50 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当系统温度上升至72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、G、C、T)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。返回目录 4PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是()A反复洗涤 B用酒精擦洗C高压灭菌 D在20 条件下储存答案 C 解析 为了避免外源D
17、NA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。返回目录 5PCR技术是把一个DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段，基本过程如图所示：返回目录(注：图中短线表示每次扩增过程中需要的引物。每个引物约含20个核苷酸，并分别与两条单链DNA结合，其作用是引导合成DNA子链。)(1)PCR技术的原理是模拟生物体内_的过程。返回目录(2)PCR扩增过程中需要对DNA片段进行高温处理，其目的是_，此过程在生物体内称为_，需_酶的参与。(3)假如引物都用 3H标记，从理论上计算，所得DNA分子中含有3H标记的占_。返回目录 解析(1)PCR技术的原理是模拟生物体内的DNA复制过程。(2)PCR扩增过程中，通过高温处理使DNA分子的两条链之间的氢键断开成为单链，该过程在生物体内称为解旋，需要解旋酶参与。(3)若引物用3H标记，不论循环多少次，所合成的DNA分子都具有放射性，即占100%。答案(1)DNA复制(2)使DNA的两条链彼此分开 解旋 解旋(3)100%返回目录 课后限时作业
