1、考点二微生物的分离、培养及应用1.图解识记微生物的培养、分离与计数2.熟记微生物分离与计数的两个实例（1）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：筛选菌株：利用选择培养基筛选菌株。测定微生物数量的常用方法：活菌计数法（或稀释涂布平板法）和显微镜直接计数。过程：土壤取样样品稀释微生物的培养与观察。鉴定方法：含酚红指示剂的以尿素为唯一氮源的培养基细菌指示剂变红，则该菌能分解尿素。（2）分解纤维素的微生物的分离：实验原理：即：可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。流程：土壤取样选择培养梯度稀释涂布平板挑选菌落。3.理清微生物培养的“5”种基本技术（1）培养基的制备：计算称量溶化灭菌倒平板。（2）无菌技术
2、：主要包括消毒和灭菌。（3）倒平板操作：待培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。（4）平板划线操作：平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。注意划线的方法（如图）。（5）稀释涂布平板法：先将菌液进行一系列的梯度稀释然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。1.微生物培养基主要含有碳源、氮源、水和无机盐四类物质。除此之外往往还需加入生长因子、调节pH等。加入琼脂则为固体培养基。加入抗生素可抑制细菌生长。2.培养基
3、按作用（功能）分为：选择培养基和鉴别培养基；按物理属性分为：固体培养基和液体培养基。补充：液体培养基可用于快速扩增微生物；而纯化和计数必须用固体培养基。注意：获得纯净微生物的关键是无菌技术（防止杂菌污染）。3.培养基用高压蒸汽灭菌；接种环用灼烧灭菌；玻璃器皿用干热灭菌。4.用伊红美蓝培养基可鉴定大肠杆菌，菌落呈现黑色。5.微生物的纯化方法：平板划线法和稀释涂布平板法。纯化的目的：获得单菌落。6.菌落的概念：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。7.菌落的特征：形状、大小、隆起程度和颜色等，都可以用于鉴定菌种。8.微生物的计数方法：（1）显微镜直接计数法（比实际值偏大）因为死菌和活菌都统计了
4、；（2）稀释涂布平板法（比实际值偏小）因为两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落（单菌落）。9.稀释涂布平板法计数注意点：（1）计数时，每个稀释浓度一般涂布3个平板；（2）计数所用平板中的菌落在30300之间；（3）计算统计的菌落数不一定是活菌数；（4）统计值比实际值偏小，计算公式：稀释倍数单位：个/mL注意：该公式基于原液为1 mL。若原液为1 L中取了1 mL进行梯度稀释，那么在总数上乘1 000，单位为个/L。10.菌种的保存方法：临时保藏用试管的固体斜面培养基接种后保藏在4冰箱中；长期保存用甘油管藏法。1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？提示：平板正置时，平板冷凝后，皿盖上
5、会凝结水珠，将平板倒置，既可以避免培养基表面的水分挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。2.微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？提示：不是。微生物的接种方法还包括斜面接种、穿刺接种等，其核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。3.得到3个或3个以上菌落数在30300的平板一定正确吗？提示：如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30300”，但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大，应找出原因并重新进行实验。微生物培养实验中的常见的两种对照组与一种重复组的作用分别是什么？提示：（1）若将未接种的选择培养基与接种的选择培
6、养基一起培养用于确认培养基灭菌是否彻底（制备是否合格）。（2）若将接种的普通培养基与接种的选择培养基一起培养用于确认选择培养基是否起到“筛选”作用。（3）进行微生物计数时，每一稀释度下涂布三个平板，即设置重复组，是为了求平均值，提高计数准确度。1.（2020全国卷）某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。回答下列问题：（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是
7、。甲、乙培养基均属于培养基。（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2107个/mL，若要在每个平板上涂布100 L稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释倍。（3）在步骤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是（答出1点即可）。（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤_。（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即。解析：（1）常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶，乙为固体培养基，故需要加入Y琼脂；甲和乙培养基可以用于筛选能
8、降解S的菌株，故均属于选择培养基。（2）若要在每个平板上涂布100 L稀释液后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，则摇瓶M中的菌液稀释的倍数至少为21071 0001002001104倍。（3）当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。（4）要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。（5）甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源。答案：（1）高压蒸汽灭菌琼脂选择（2）104（3）S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长（4）取淤泥加入无菌水，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培养后计数（5
9、）水、碳源、氮源和无机盐2.（2020江苏卷）产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：（1）常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是（填编号）。编号物品培养基接种环培养皿涂布器灭菌方法高压蒸汽火焰灼烧干热臭氧（2）称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌个。（3）为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行育种。将辐照处理后的酵母菌涂
10、布在以为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。（4）在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株进行后续相关研究，理由是_。解析：（1）培养基一般进行高压蒸汽灭菌，接种环可用火焰灼烧灭菌，培养皿一般通过干热灭菌，涂布器应该用酒精引燃灭菌；故正确，错误的是。（2）稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液，然后涂布到平板上。根据题意，1.0 g土壤样品转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经系列梯度稀释后，分别
11、取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，则稀释的倍数为1 000倍，其中10倍稀释的菌悬液培养后长出了46个酵母菌落，则总的稀释倍数为10 000倍，故每克土壤中含酵母菌数为4610 0004.6105个。（3）根据题意，欲提高酵母菌产酶能力，可对分离得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐射，该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产脂肪酶酵母菌突变株，可配制以脂肪为唯一碳源的培养基，将辐射处理的酵母菌涂布在该固体培养基上，形成单菌落；产脂肪酶能力越强的酵母菌，分解利用脂肪的能力越强，菌落生长越好，一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选取直径较大的菌落即可。（4）据题图分析可知，相同时间内，
12、菌株B的细胞密度高于菌株A，而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量，故进行相关研究可选择菌株B，原因是菌株B增殖速度快，单细胞蛋白的产量也高，同时降解脂肪的能力强，净化效果更好。答案：（1）（2）梯度稀释4.6105（或460 000）（3）诱变脂肪（或油脂）较大（4）B该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好热点1微生物的实验室培养与无菌技术1.（2020广州一模）现已知细菌的抑藻方式有直接抑藻（细菌与藻细胞直接接触）和间接抑藻（细菌分泌胞外抑藻物质）两种方式。研究人员从养殖场新鲜养殖废水中筛选出了一株对某有害水华藻具高效抑藻能力的菌株，大致过程如下：制备养殖废水稀
13、释液接种于固体培养基细菌纯化培养发酵液抑藻实验筛选菌株。回答下列问题。（1）培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是（填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaCl”）。为避免由于微生物繁殖导致培养基，而不适宜使用，配制好的培养基要立即进行灭菌。（2）制备不同浓度的养殖废水稀释液时每次都要更换无菌移液管，原因是_。（3）为探究该菌株的抑藻方式，将适量去除菌体的发酵液（甲组）、含菌体的发酵液（乙组）和无菌培养基（丙组）分别加入到有害水华藻液中，适量条件培养一段时间，统计有害水华藻的数量。若，表明该菌株能进行间接抑藻。（4）对该菌株的胞外物质进行透析，在截留分子量分别为1 000Da、500Da和100Da（Da
14、表示单位）的透析袋（作用与半透膜相似）透析后，发现袋内物质抑藻能力分别是无、有和有。这表明提取出来的抑藻物质的分子量范围最可能是。解析：（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是蛋白胨。获得纯净的培养基是研究和应用微生物的前提，为避免由于微生物繁殖导致培养基污染，操作者需用酒精擦拭双手消毒，对金属用具、玻璃器皿、培养基等要进行灭菌，其中，培养基只能用高压蒸汽灭菌。（2）制备不同浓度的养殖废水稀释液时需要使用移液管。洗净后的移液管内壁应不挂水珠。移取溶液前，应先用滤纸将移液管末端内外的水吸干，每次使用时需更换无菌移液管，原因是使用过的移液管中的残留液会改变所移取溶液的浓度，影响实验
15、结果。（3）为探究该菌株的抑藻方式，自变量是抑藻物质，因变量是水华藻细胞数量。其中甲、乙两组加入的是含菌体的发酵液与水华藻细胞，为间接抑藻（细菌分泌胞外抑藻物质）；丙组加入的是无菌培养基与水华藻细胞，为空白对照。若该菌株能进行间接抑藻，则甲、乙两组水华藻细胞的数量均明显低于丙组。（4）从题干信息可知，用截留分子量为1 000Da的透析袋对该菌株的胞外物质进行透析后，袋内物质无抑藻能力，说明菌株胞外物质可以透过截留分子量为1 000Da的透析袋；用500Da和100Da的透析袋对该菌株的胞外物质进行透析后，袋内物质有抑藻能力，说明菌株胞外物质不能透过截留分子量为500Da和100Da的透析袋。这
16、表明提取出来的抑藻物质的分子量范围最可能在500Da1 000Da之间。答案：（1）蛋白胨污染高压蒸汽（2）使用过的移液管中的残留液会影响结果（3）甲组和乙组的水华藻数量均明显低于丙组（4）大于500Da且小于1 000Da（或“500Da1 000Da”）2.（2020广东六校联考）海洋藻类上常附着有多种微生物，其中部分在生物医药和日用化工等生产领域具有重要的经济价值，而部分会产生某些毒素污染环境或毒害动物，人们需要对它们进行大量的研究。请回答下列问题：（1）若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，正确的是图，其正确操作过程中，划线工具至少要灼烧次。（2）长期保存菌种时，应将培养的菌液与充分
17、混匀后，放在20 的冷冻箱保存，丢弃已经接种过微生物的培养基前，往往需要先行灭菌，以免_。（3）A、B两组同学用稀释涂布平板法测定某种微生物的数量，在同一稀释倍数下每隔一段时间记录数据（统计时间内微生物总数在增长过程中），得到以下结果培养时间（小时）24487296A组菌落均值（个）18253632B组菌落均值（个）20283832计数时最好取72小时记录的菌落数作为实验结果，原因是_；_。（4）发酵工程常常需要对某些微生物进行固定，最常用的方法是法。某真菌产生的油脂不易挥发，可选用（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。解析：（1）由分析可知：若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，
18、图B是正确的，其正确操作过程中，由图中的划线区域共四个，取菌种前以及每次划线前和最后划线完毕都有灼烧，故划线工具至少要灼烧5次。（2）菌种长期保存的方法是甘油管藏法，故应将培养的菌液与甘油充分混匀后，放在20 的冷冻箱保存，为了避免污染环境或者对其他生物产生毒害，丢弃已经接种过微生物的培养基前，往往需要先行灭菌。（3）为避免因为培养时间不足，遗漏菌落数目，或培养时间过长，两个或多个菌落连成一个菌落，影响计数的结果，故最好取72小时记录的菌落数作为实验结果。（4）对于细胞经常用包埋法进行固定，故对某些微生物进行固定，最常用的方法是包埋法。对于不易挥发的某真菌产生的油脂，可选用萃取法从菌体中提取。
19、答案：（1）B5（2）甘油污染环境或者对其他生物产生毒害（3）培养时间不足，遗漏菌落数目；培养时间过长，两个或多个菌落连成一个菌落（两空位置可以互换）（4）包埋萃取法制备选择培养基的3个常用方法（1）在基本培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上进行的。（2）改变培养基中的营养成分。例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。（3）改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。热点2综合考查微生物的培养、分离、计
20、数及应用3.（2020深圳一模）某生物兴趣小组探讨从土壤中分离能够分解纤维素的微生物。回答下列问题。（1）分解纤维素的微生物将纤维素水解后氧化分解的最终产物是。（2）该小组将富含纤维素的土壤作为土样，加入至选择培养基中进行振荡培养，此阶段培养目的是。吸取上述培养液，稀释涂布到加入了（染料）的另一种培养基，以筛选出纤维素分解菌，并根据菌落周边所出现的大小初步判断纤维素分解菌分解能力的大小。（3）利用稀释涂布平板法测定细菌数时，每个稀释度至少涂布个平板。小组中甲同学在某稀释浓度下筛选出150个菌落，其他同学在该浓度下只筛选出大约50个菌落。乙同学分析甲的实验结果与其他同学差异的原因可能是（答一项即
21、可），为了验证这一分析，进一步实验的思路是_。解析：（1）分解纤维素的微生物将纤维素水解后得到葡萄糖，葡萄糖氧化分解的最终产物是二氧化碳和水。（2）振荡可以增加溶氧量及微生物与营养物质的接触，此阶段培养目的是增加所需微生物的的浓度（使目的微生物得到迅速繁殖）。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，吸取上述培养液，稀释涂布到加入了刚果红（染料）的另一种培养基，以筛选出纤维素分解菌。并根据菌落周边所出现透明圈的大小初步判断纤维素分解菌分解能力的大小，直径越大，分解能力越强。（3）利用稀释涂布平板法测定细菌数时，每个稀释度至少涂布3个平板，以减小误差。甲的菌落数过多，可能是培养基被污染。为了验证
22、这一分析，可以用甲同学配制的同批培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照或进行重复实验。答案：（1）二氧化碳和水（2）增加所需微生物的的浓度（使目的微生物得到迅速繁殖）刚果红透明圈（3）3培养基被污染用甲同学配制的同批培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照（或甲所选土壤样品不一样用与甲同学一样的土壤进行重复实验）4.（2020南昌期末）为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行如图A所示的实验。（1）配制好的培养基灭菌通常可以使用法。步骤与步骤中培养基成分的最大区别是。（2）同学甲进行过程的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法
23、是；推测同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是。（3）同学乙也按照同学甲的接种方法进行了过程的操作：将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为。（4）步骤需要震荡培养其目的是提高培养液溶氧量，同时使，提高营养物质利用率。（5）步骤后取样测定石油含量的目的是_。解析：（1）根据题意，要分离和纯化高效分解石油的细菌，配制好的培养基灭菌通常可以使用高压蒸汽灭菌法。图中步骤是扩大培养来自被石油污染过的土壤中细菌
24、，步骤是利用添加石油扩大培养分解石油的细菌，步骤与步骤中培养基成分的最大区别是步骤的培养基中石油是唯一碳源。（2）过程是对分解石油的细菌进行分离，分析B图可知，分解石油的细菌在培养基表面分布较为均匀，说明同学甲进行过程的操作中接种方法是稀释涂布平板法；图B中培养基表面左侧的菌落数目明显比右侧多，推测同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是接种时涂布不均匀；在接种前需随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。（3）同学乙也按照同学甲的接种方法进行了过程的操作：将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3
25、个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为（565857）30.11001 0005.7107。（4）步骤需要震荡培养其目的是提高培养液溶氧量，同时使菌体与培养液充分接触，提高营养物质利用率。（5）步骤后取样测定石油含量的目的是筛选出分解石油能力最好的细菌，其中石油剩余量最少的一组所含的细菌就是分解石油能力最好的细菌。答案：（1）高压蒸汽灭菌石油是唯一碳源（2）稀释涂布平板法涂布不均匀检测培养基平板灭菌是否合格（3）5.7107（4）菌体与培养液充分接触（5）筛选出分解石油能力最好的细菌5.（2020陕西模拟）测定水样是否符合饮用水的卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌
26、的总数。大肠杆菌在含有伊红美蓝的固体培养基（EMB培养基）上长出的菌落呈黑色。如图所示；滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样水样中的细菌留在滤膜上将滤膜转移到EMB培养基上培养统计菌落数目。据图回答问题。（1）过滤待测水样需要用到滤杯、滤膜和滤瓶，其中需要经过灭菌处理的是。与过滤有关的操作都要在酒精灯火焰旁进行。（2）待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为_。（3）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的操作。从功能上看，EMB培养基属于培养基。（4）无菌操作下将90 mL无菌水加入到10 mL待测水样中，这样就将待测水
27、样稀释了倍，将稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数为45，黑色菌落为5，则1升待测水样中的大肠杆菌数目为个。（5）若要测定待测水样中酵母菌的数目，应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径（填“更大”或“更小”）的滤膜。解析：试题分析：滤膜法是检测水样中大肠细菌群的方法。将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的大肠菌群菌落，依据过滤水样计算每升或每100毫升水样中的大肠菌群数。操作简单、快速，主要适用于杂质较少的水样。（1）过滤待测水样需要用到滤杯、滤膜和滤瓶，这些实验仪器都需要经过灭菌处理，与过滤
28、有关的操作都要在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌的污染。（2）待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，此时可以在无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上。（3）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，属于微生物培养中的接种操作。从功能上看，该培养基中含有伊红美蓝，因此EMB培养基属于鉴别培养基。（4）无菌操作下将90 mL无菌水加入到10 mL待测水样中，这样就将待测水样稀释了10倍；根据大肠杆菌鉴定的原理可知，黑色菌落为大肠杆菌，因此1升待测水样中的大肠杆菌数目5（1 00010）500个。（5）若要测定待测水样中酵母菌的数目，酵母菌属于真核生物，大肠杆
29、菌属于原核生物，真核细胞的直径比原核细胞大，因此应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径更大的滤膜。答案：（1）滤杯、滤膜和滤瓶（2）无菌条件下用无菌水冲洗滤杯，再次过滤（3）接种鉴别（4）10500（6）更大有关微生物利用的几个易错点（1）分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。（2）倒平板的温度一般在50 左右适宜，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。（3）平板需倒置，可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。（4）平板划线法只适用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。（5）平板划线法中的“连续划线”及稀释涂布平板法中的“系列稀释”目的是一样的，都是为了保证菌种在培养基中单个分布（平板划线法中最后一次划线的末端）。（6）利用平板菌落计数法的计算公式估算水样中的活菌数：M（稀释倍数）。（7）分离能分解纤维素的微生物时，有时需要进行选择培养，选择培养的目的是增大选择对象在样液中的浓度，以确保用刚果红染色法鉴别时确实能得到所需菌种。
