1、专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 学习目标：1.理解 PCR 的原理。(重点)2.体验 PCR 这一常规的分子生物学实验的方法。(难点)3.了解 PCR 的应用。(重点)自 主 预 习 探 新 知 1PCR 扩增的原理和过程(1)细胞内 DNA 复制过程的解析 解旋：在_酶作用下，DNA 两条链打开，形成两条 DNA 单链 解旋引物结合：在 DNA 单链_端，通过_与 DNA 母链结合 DNA 聚合酶结合：DNA 聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始 3碱基互补配对子链合成：_酶从引物_端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来 后续加工：将_切去，并合成空缺处的 D
2、NA 单链，再由_酶将不连续的 DNA 子链连接起来，子链和母链再形成_结构 DNA聚合3引物DNA连接双螺旋(2)PCR 技术的原理 PCR 技术：即_，是一种_迅速_的技术。它能以极少量的_为模板，在几小时内复制出上百万份的 DNA 拷贝。子链扩增：需要_，合成方向总是从子链的_端向_端延伸。多聚酶链式反应体外扩增DNA片段DNA 引物53解旋原理：DNA 的热变性原理。在_的温度范围内，DNA 的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为_。当温度缓慢_后，两条彼此分离的 DNA 链又会重新_。80100 变性降低结合成双链条件 _：DNA 的两条链。_：分别与模板 DNA 两条模板链相结
3、合的两种小的核酸片段。原料：A、T、G、C 四种_。模板引物脱氧核苷酸酶：_酶，一般用耐高温的 TaqDNA 聚合酶。其他条件：需要一定的_溶液和能严格控制温度的温控设备。耐热DNA聚合缓冲(3)PCR 技术的过程 变性 当温度上升到 90 以上时，双链 DNA_为单链。解旋复性 温度下降到 50 左右，两种引物通过_与两条单链DNA 结合。碱基互补配对延伸 温度上升到 72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在 DNA 聚合酶的作用下，根据_原则合成新的 DNA链。碱基互补配对2PCR 的实验操作及操作提示(1)实验用具 PCR 仪：该仪器能自动调控_，实现 DNA 的扩增。如果
4、没有 PCR 仪，可用 3 个_水浴锅代替，操作时按程序在 3 个水浴锅中来回转移 PCR 反应的微量离心管。微量离心管：总容积为_ mL，实际上是进行 PCR 反应的场所。微量移液器：用于向微量离心管中转移 PCR 配方中的液体。温度恒温0.5(2)实验操作程序 准备：按照 PCR 反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上 移液：用_按照配方在微量离心管中依次加入各组分 微量移液器混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液_ 离心：将微量离心管放在离心机上，离心约 10 s。目的是使反应液集中在_ 反应：将离心管放入_中，设置程序进行反应 混合均匀离心管底部PCR仪(3)实验操作注
5、意事项 为避免外源 DNA 等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行_。所用的缓冲液和酶应分装成_，并在_储存。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须_。高压灭菌小份20 更换(4)DNA 含量的测定 原理：利用 DNA 在_的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。计算公式：DNA 含量(g/mL)_稀释倍数。260 nm50(260nm的读数)1判断对错(1)PCR 技术利用的是碱基互补配对原则。()(2)PCR 技术可用于基因诊断、判断亲缘关系等。()(3)PCR 技术需在体内进行。()(4)PCR 技术可能为变性、复性、延伸三个阶段。()提示：(1)
6、(2)(3)PCR 技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制 DNA 片段的一种新技术。(4)2PCR 技术控制 DNA 的解聚与结合是利用了 DNA 的()A特异性 B稳定性 C热变性D多样性 C DNA 分子在 80100 的温度范围内变性，双链解开成单链；当温度缓慢降低时，又能重新结合形成双链。合 作 探 究 攻 重 难 PCR扩增的原理和过程 合作交流 1什么是引物？DNA 复制时为什么需要引物？提示：所谓引物是指两段与待扩增的 DNA 序列互补的一小段DNA 或 RNA 片段。在 DNA 扩增时，DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从引物的 3端延伸 DNA 链，因此
7、克隆 DNA 时应加入两种引物。2PCR 扩增 DNA 过程中是否还需要解旋酶？提示：不需要。3PCR 技术中需要的两种引物碱基序列相同吗？为什么？提示：不同。由于 DNA 两条模板链中碱基序列并不相同，引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此 DNA 两条模板链在进行扩增时，需要的引物碱基序列是不同的。归纳总结 1生物体内的 DNA 复制与 PCR 反应的比较 体内 DNA 复制PCR 反应 解旋在解旋酶的作用下，边解旋边复制加热至 90 以上时，双链全部解开 不同点酶解旋酶、DNA 聚合酶耐高温的 DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶)引物一小段 RNARNA 或单链 DNA 分子
8、片段 合成 子链一条子链连续合成，另一条子链不连续合成两条子链都是连续合成 不同点温度体内温和条件高温 相同点都需提供 DNA 复制的模板 都需要四种脱氧核苷酸原料 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物 子链延伸的方向都是从 5端到 3端 2.PCR 的反应过程(如图所示)PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板 DNA 彻底变性的概率。特别提醒：(1)耐热的 DNA 聚合酶一般用 Taq DNA 聚合酶。TaqDNA 聚合酶是从水生耐热细菌 Taq(发现于美国黄石国家公园的一个热泉中)中分离得到的。耐高温的 T
9、aq DNA 聚合酶的发现和应用解决了高温使酶失活的问题，大大增加了 PCR 的效率，使 PCR 技术趋向自动化。(2)从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合，进行 DNA 的延伸，这样，DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的 DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增(例如，若只有一个 DNA作为模板，则复制 n 次后，DNA 数目为 2n)。典题通关 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。PCR 过程一般经历三十多次下述循环：95 下变性(使模板 DNA 解旋)55 下复性(引物与 DNA 模板
10、链结合)72 左右延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关 PCR 过程的叙述中，不正确的是()A在 PCR 的变性过程中破坏的是 DNA 分子内碱基对之间的氢键，DNA 在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现 B复性过程中引物与 DNA 模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的 C延伸过程中需要耐高温的 DNA 聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 DPCR 与细胞内 DNA 复制相比所需要酶的最适温度较高 C 变性是为了使 DNA 内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；根据碱基互补配对原则，引物可与 DNA 模板链结合；延伸是形成新的 DNA 分子，需要以四种脱氧核苷酸
11、为原料；PCR 过程所需温度较高，会导致一般的 DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的 DNA 聚合酶。(1)DNA 的复性过程是不是两条母链重新螺旋化成为双链 DNA 分子的过程？(2)某 DNA 分子通过 PCR 技术扩增了 n 次，含某种引物的 DNA分子数目是多少？提示：(1)不是，复性是指温度降低到 55 时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合的过程。(2)一个 DNA 分子经过 n 次扩增，共形成 2n 个 DNA 分子，其中只有两个 DNA 分子只含有一个引物(引物和引物)，其余的 DNA分子同时含有两种引物，所以含某种引物的 DNA 分子数目为 2n1。有关 PCR
12、技术的下列叙述，不正确的是()A聚合酶链式反应，是用 DNA 聚合酶在体外扩增 DNA 片段的技术 B在用 PCR 技术扩增 DNA 时，DNA 的复制过程与细胞内 DNA的复制类似 CPCR 反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供 DNA 模板以及四种脱氧核苷酸即可 DPCR 一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段 C PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供 DNA 模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的 DNA 聚合酶，同时通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行。PCR技术的实验操作 合作交流 1PCR 循环过程中，变性温度设置 9
13、5，时间设置 30 s 的原因是什么？提示：变性温度过低，解旋不完全导致 DNA 不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。2在 PCR 过程中，延伸的温度为什么控制在 72？提示：在 72 左右时，Taq DNA 聚合酶活性最高。在 TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的 DNA 链。归纳总结 1DNA 含量的测定 DNA 在 260 nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与 DNA 含量有关。可以利用 DNA 的这一特点进行 DNA 含量的测定，具体方法如下：稀释取2 L PCR反应液，加入98 L蒸馏水，将样品进行50倍稀释 对照调零以蒸
14、馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 测定取DNA稀释液100 L至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值 计算DNA含量（g/mL）50（260 nm的读数）稀释倍数 2PCR 技术的应用(1)医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。(2)对单细胞中的 DNA 进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用。(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定。(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。(5)在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生
15、物等。典题通关 聚合酶链式反应(PCR 技术)是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，由变性、复性及延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的 DNA 得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于 PCR技术的叙述，不正确的是()APCR 技术是在实验室中以少量 DNA 制备大量 DNA 的技术 B反应中新合成的 DNA 又可以作为下一轮反应的模板 CPCR 技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增 D应用 PCR 技术与探针杂交技术可以检测基因突变 C PCR 技术是人工合成 DNA 的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。(1)PCR 反应过程中最重要的就是温度控制，DNA变性、复性
16、及延伸分别需要怎样的温度条件？(2)在教材 P62 中的 PCR 反应体系的配方中，除了有模板 DNA、原料、引物、聚合酶等外，还要加入缓冲液，加入缓冲液的目的是什么？提示：(1)变性为 95，复性为 55，延伸为 72。(2)维持 PCR 反应所需要的 pH。使用 PCR 仪的具体实验操作顺序应为()设计好 PCR 循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分 进行 PCR 反应 离心，使反应物集中在离心管底部 A B CD C PCR 反应的操作步骤一般分为准备(包括将配方所需各组分放于实验台上)移液混合离心反应。因 PCR 仪是一种能自动控制温度的仪器，设计好循
17、环程序就可以进行反应了。课堂小结知 识 网 络 构 建核 心 语 句 归 纳 1.DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从 3端延伸 DNA 链，因此，DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸。2PCR 反应需要 DNA 模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的 DNA聚合酶等条件。3PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。4PCR 每次循环都包括变性、复性和延伸三步，对应的温度分别为 95、55 和 72。5DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的 DNA 序列。6PCR 扩增 DNA 片段可以使目的片段呈指数增长。当 堂 达 标 提 素
18、养 1PCR 技术扩增 DNA，需要的条件是()目的基因 引物 四种脱氧核苷酸 DNA 聚合酶等 mRNA 核糖体 A B CD A PCR 技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA 聚合酶催化反应的进行，而引物是满足 DNA 聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料。2下图中 PCR 第二轮产物 a、b、c、d 分别是以 PCR 第一轮产物的哪一条单链 DNA 为模板复制产生的()AB CD D 因为 PCR 的反应过程需要引物，在第二轮循环过程中，a、d 的引物分别为、，无引物的为模板链(即、)，则 b、c 的模板链分别为、。故选 D。3下列关于操作过程的叙述，错误的是()APCR
19、实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 BPCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存 CPCR 所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 C 在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即 C 项错误。故选 C。4在遗传病及刑事侦破案件中常需要对样品 DNA 进行分析，PCR 技术能快速扩增 DNA 片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA 拷贝，有效地解决了因为样品中 DNA 含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：(1)在
20、相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的 DNA 分子。(3)若将作为原料的 4 种脱氧核苷酸用 32P 标记，请分析循环一次后生成的 DNA 分子的特点：_，循环 n 次后生成的 DNA 分子中不含放射性的单链占总单链的比例为_。(4)PCR 反应过程的前提条件是_，PCR 技术利用 DNA的_原理解决了这个问题。(5)在对样品 DNA 进行分析的过程中发现，DNA 掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是_。解析(1)DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从 3端延伸 DNA 链，所以引物就提供了 3端，子链延伸方
21、向为 53，引物与 b 链部分碱基互补，引物则与 a 链部分碱基互补，且连接到 a链的 3端，故引物的结构为 5GAOH，复性结果为：HOAG5 GGTC3(2)经过一次循环后，产生的两个 DNA 分子分别含有引物和引物。(3)由于作为原料的 4 种脱氧核苷酸被 32P 标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个 DNA 中各有一条链含 32P，若复制 n 次，共产生子链 2n2，其中只有 DNA 母链不含 32P，则其所占比例为 2/(2n2)1/2n。(4)DNA 复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。因此，首先要解旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对原则把相应的碱基一个个地连接起来。DNA 分子在 80100 的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。(5)DNA 中杂质蛋白的去除可利用酶的专一性，加入蛋白酶。答案(1)5GAOH HOAG5 5GGTC3 3CCAG5 72 (2)3CCAG5 5GGTC3 5GGTC3 3CCAG5(3)每个 DNA 分子各有一条链含 32P 1/2n(4)DNA 解旋 热变性(5)蛋白酶点击右图进入 课 时 分 层 作 业 Thank you for watching!
