1、专题5 DNA和蛋白质技术【高考目标导航】1、蛋白质的提取和分离2、PCR技术的基本操作和应用【基础知识梳理】一、DNA的粗提取与鉴定1、实验原理：DNA与杂质的溶解度不同，DNA与杂质对酶、高温、洗涤剂的耐受性不同2、实验设计：实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大，如鸡血、菜花、洋葱等。破碎细胞：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，用纱布过滤后收集滤液即可。去除滤液中的杂质：利用DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，控制NaCl溶液的浓度去除杂质。 DNA的析出：
2、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。DNA的鉴定：取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。二、多聚酶链式反应扩增DNA片段1、PCR原理：DNA的热变性2、PCR反应过程（1）变性：当温度上升到90以上时，
3、双链DNA解聚为单链（2）复性：温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合（3）延伸：温度上升到72左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸（A,T,C,G）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。三、血红蛋白的提取和分离实验1、方法及原理方法原理凝胶色谱法根据相对分子质量的大小分离蛋白质电泳法各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同来分离蛋白质2、操作程序：（1）样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液（2）粗分离透析：除去样品中相对分子质量较小的杂质。（3）纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。（4）纯度鉴定：一般用SD
4、S-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。3、细胞内DNA复制与PCR技术的比较细胞内DNA复制PCR不同点解旋在解旋酶作用下边解旋边复制80100高温解旋，双链分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA温度体内温和条件高温相同点（1）需提供DNA复制的模板（2）四中脱氧核苷酸作原料（3）子链延伸的方向都是从5端到3端（4）都需要酶的催化【要点名师透析】一、DNA和蛋白质的技术1、比较细胞内DNA复制与DNA扩增（PCR）2.血红蛋白的提取和分离方法(1)凝胶色谱法含义：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。原理a.相对分子质量较
5、小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。b.相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。(2)电泳法含义：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。原理：利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异和分子本身大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。(3)缓冲溶液组成：12种缓冲剂溶解于水中配制而成。作用：在一定范围内抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变，确保实验室条件下能准确模拟生物体内的代谢过程。【感悟高考真题】1、（2011江苏高考）在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关
6、叙述正确的是()A.用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物B.调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质C.将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色D.用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同【解析】A项，用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 molL,使DNA析出。B项，NaCl溶液为2molL，过滤除去不溶的杂质，木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。C项，在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。D项，如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。【答案】B2、（2010广东高考）新技术的建立和应用对生物学发展至关重要
7、。下列技术（或仪器）与应用匹配正确的是 A. PCR技术扩增蛋白质 B.杂交瘤技术制备单克隆抗体 C.光学显微镜观察叶绿体的基粒 D.花粉离体培养培育单倍体植物【解析】本题主要考查学生的理解能力。PCR技术只能用来扩增核酸，不能用来扩增蛋白质；利用光学显微镜无法观察到叶绿体。【答案】BD3、（2010江苏高考）某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份每份l0 g。剪碎后分成两组，一组置于20、另一组置于一20条件下保存24 h。DNA粗提取：第一步：将上述材料分别放人研钵中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤取滤液备用
8、。第二步：先向6只小烧杯中分别注人10mL滤液，再加人20 mL体积分数为95的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。第三步：取6支试管，分别加入等量的2 molL NaCl溶液溶解上述絮状物。DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂。混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅,结果如下表。分析上述实验过程，回答下列问题：(1)该探究性实验课题名称是 。(2)第二步中”缓缓地”搅拌，这是为了减少 。(3)根据实验结果，得出结论并分析。 结论1：与20相比，相同实验材料在-20条件下保存，DNA的提取量较多。 结论2： 。 针对结
9、论I请提出合理的解释： 。(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是： 。然后用体积分数为95的冷酒精溶液使DNA析出。【解析】本题考查了DNA粗提取技术的原理、操作过程及同学分析、判断能力，从题目实验看出，该实验的课题是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。在试用第二步中，为了防止DNA断裂，要缓缓的搅拌，从表中结果看出，由于低温抑制了相关酶的活性，DNA降解慢，使得相同材料在低温保存下，DNA提取量大，在相同条件先，蒜黄蓝色最深，说明相同条件下从蒜黄中提取
10、的DNA量最大，由于氯仿密度比水大，可使蛋白质变性后沉淀，而与水、DNA不相溶，这样可将第三步获得的溶液与等量的氯仿混合，静置一段时间，吸取上清液即可得到较纯净的DNA。【答案】（1）探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响（2）DNA断裂（3）等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多低温抑制了向光酶的活性，DNA降解速度慢（4）将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液4、（2009江苏高考）下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有 A提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水涨破细胞 B用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA
11、可去除蛋白质C蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNAD蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化 【解析】A选项，在提取DNA时，如果是用动物的细胞需要用蒸馏水涨破，如果用植物细胞则不需要，而是用洗涤剂溶解细胞膜；用2 molL的NaCl溶液溶解DNA，然后过滤出蛋白质，再降低NaCl溶液的浓度，析出DNA。DNA和蛋白质样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。C中透析用以出去小分子物质，DNA是大分子物质，D是常规方法比如用十二烷基磺酸钠，可以根据其分子大小及所带电荷性质进行分离纯化【答案】BD【考点模拟演练】一、选择题1、下列是有关血红蛋白提取和
12、分离的相关操作，其中正确的是()A可采集猪血作为实验材料B用蒸馏水重复洗涤红细胞C血红蛋白释放后应低速短时间离心D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液【解析】为防止细胞吸水涨破，洗涤时要用生理盐水；释放出血红蛋白后，以2 000 r/min 的高速离心；在分离时，要等到红色蛋白质接近色谱柱底端时开始收集流出液。【答案】A2、对“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是()A利用DNA能溶于酒精溶液，而蛋白质不溶于酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离B利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，可将DNA与蛋白质分离C在溶有DNA的2 mol/L氯化钠溶液中缓缓加入蒸馏水，轻轻搅拌后过滤，取
13、滤液进行以后的实验D在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA 与蛋白质分离【解析】利用DNA不溶于酒精溶液，蛋白质溶于酒精溶液的特点，可将DNA与蛋白质分离；高温能使蛋白质、DNA变性，蛋白质在6080可变性，而DNA在80以上也会变性，所以高温对DNA有影响；在溶有DNA的2 mol/L氯化钠溶液中缓缓加入蒸馏水，轻轻搅拌后过滤，得到DNA黏稠物，用DNA黏稠物进行以后的实验；在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的专一性作用，可将DNA与蛋白质分离。【答案】D3、(2011镇江模拟)下列对有关实验的叙述，不正确的是()A血红蛋白的提取和分离实验中使用的交联葡聚糖凝胶G7
14、5，其中“75”表示每克凝胶膨胀时吸水7.5克B在色素的提取和分离的实验中，叶绿素b在层析液中的溶解度最低，扩散速度最慢C用洋葱作实验材料进行DNA的粗提取与鉴定实验时，加入一定的食盐的目的是有利于溶解DNAD制取细胞膜、血红蛋白的提取和分离均以鸡血细胞作为实验材料【解析】血红蛋白的提取和分离以鸡血细胞作为实验材料；制取细胞膜不能用鸡血细胞，鸡血细胞有核膜及其他细胞器膜。【答案】D4、有关“血红蛋白提取和分离”的相关叙述中，不正确的是()A可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度B将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质C血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白
15、溶于有机溶剂D整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构【解析】可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度。将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是溶解细胞膜。整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构。【答案】C5、聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是()APCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术B反应中新合成的DNA又
16、可以作为下一轮反应的模板CPCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增D应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变【解析】PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。【答案】C6、蛋白质的提取和分离分为哪几步()A样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳B样品处理、凝胶色谱操作、纯化C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定【解析】蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程的技术。【答案】C7、下列关于DNA的粗提取实验和血红蛋白的提取实验，叙述正确的是()A
17、前者选择鸡血细胞作为材料较好，后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好B样品预处理时，前者静置1天处理除去上清液；后者需要加入清水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无黄色C在DNA粗提取实验中，往2 mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应该缓慢加入，直到出现黏稠物即止D洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等【解析】鸡血细胞有细胞核，适于提取DNA；哺乳动物成熟红细胞无细胞核和众多细胞器，适用于提取血红蛋白。提取血红蛋白的实验中，洗涤红细胞时，不能加清水，应该加入生理盐水，否则细胞提早释放出血红蛋白与杂质混合，加大提取难度。DNA初次析出时，加蒸馏水至黏稠物不再增加为止。洗
18、涤红细胞的目的是去除杂质蛋白，以利于血红蛋白的分离和纯化。【答案】A8、(2011广州模拟)蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是()A根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离B根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质C根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质D根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质【解析】蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离。【答案】A9、以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是()A红
19、细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水，重复洗涤3次B将血红蛋白溶液放在质量分数为0.9%的NaCl溶液中透析12小时C凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在D蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢【解析】红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的生理盐水，重复洗涤3次目的是除去杂蛋白。透析时使用物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，而不是用0.9%的NaCl溶液。蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的在凝胶外部移动，移动速度快。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。【答案】C10、(2011南通一模)下列有关“血红蛋白提取和分离”的相关叙述中，
20、正确的是()A用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面杂蛋白B将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质C血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂D整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构【解析】红细胞的洗涤用的是生理盐水，其目的是去除血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化，而不是去除细胞表面杂蛋白；而本实验中蒸馏水的作用是涨破红细胞使血红蛋白释放。将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是溶解细胞膜。整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构。【答案】D11、下列关于DN
21、A粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是()试剂操作作用A柠檬酸钠溶液与鸡血混合防止血液凝固B蒸馏水与鸡血细胞混合保持细胞形状C蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中析出蛋白质D冷却的酒精加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中产生特定的颜色反应【解析】柠檬酸钠溶液有抗凝血的作用。第一次加入蒸馏水是为了让细胞吸水涨破。在浓NaCl溶液(2 mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，而RNA核蛋白的溶解度很小，在稀NaCl溶液(0.14 mol/L)中DNA的溶解度最低，蛋白质的溶解度很高，而出现盐溶现象。用乙醇沉淀法可使其他物质溶于酒精而进一步纯化DNA，但不会出现颜色反应。【答案】A12、PCR一般
22、要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物延伸而成的DNA单链做模板时将( )A仍与引物结合进行DNA子链的延伸B无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链C同时与引物和引物结合进行子链延伸D与引物结合进行DNA子链的延伸【解析】PCR扩增中，从第二轮循环开始由引物延伸而成的DNA单链做模板时将与引物结合进行DNA子链的延伸；由引物延伸而成的DNA单链做模板时将与引物结合进行DNA子链的延伸。【答案】D13、PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是( )A.A过程高温使DNA变性解旋，
23、该过程不需要解旋酶的作用B.C过程要用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加C.如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“945572”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25%D.PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变【解析】高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。C过程为PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升至72左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。Taq DNA聚合酶是耐热的，高温下不变性，所以一次性加入即可。PCR技术遵循半保留复制的特点。经过三次循环，共产生23个DNA分子，其中
24、有2个DNA分子含有15N标记。基因中的碱基对改变属于基因突变。【答案】B14、(2011宁夏模拟)在采用鸡血为材料对DNA进行粗提取的实验中，如果需要进一步提取杂质较少的DNA，可以依据的原理是( )A.在物质的量浓度为0.14 mol/L的氯化钠溶液中DNA的溶解度最小B.DNA遇二苯胺在沸水浴的条件下会变成蓝色C.DNA不溶于酒精而细胞中的一些物质易溶于酒精D.质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用【解析】由于DNA不溶于酒精，而混杂在DNA中的某些细胞中的物质易溶于酒精，所以向含有杂质的DNA中加入95%的冷酒精，可以进一步提纯DNA。【答案】C15、下图表示血红蛋白提
25、取和分离的部分实验装置。下列相关叙述正确的是()A血红蛋白在红细胞中的作用体现了蛋白质具有调节功能B甲装置中A是蒸馏水，乙装置中C溶液的作用是洗脱血红蛋白C甲装置的目的是去除样品中分子量较大的杂质D乙装置分离时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液【解析】血红蛋白在红细胞中的作用体现了蛋白质具有运输功能；甲装置中A应是磷酸缓冲液；甲装置的目的是去除样品中分子量较小杂质。【答案】D二、非选择题16、红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题
26、：(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：_、_、_和_。(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_。在样品处理中包括红细胞的洗涤、_、分离血红蛋白溶液、透析。洗涤红细胞的目的是_，你如何知道红细胞已洗涤干净？_分离红细胞时对离心速度和离心时间的要求是_。若离心速度过高和时间过长结果会怎样？_。(3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是_。透析的原理是_。(4)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是_。血红蛋白有什么特点？
27、_。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？_。【解析】分离提取血红蛋白的实验流程大致是样品处理粗分离纯化纯度鉴定四个步骤。柠檬酸钠属于抗凝剂。血红蛋白是红色含铁的蛋白质。凝胶色谱法分离蛋白质是依据蛋白质的相对分子质量大小来进行的。【答案】(1)样品处理粗分离纯化纯度鉴定(2)防止血液凝固血红蛋白的释放去除杂蛋白离心后的上清液没有黄色低速短时间离心，如500 r/min离心2 min离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度(3)去除相对分子量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内(4)通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋
28、白除去血红蛋白呈现红色在凝胶色谱分离时可通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。17、1970年，特明和巴尔的摩证实了RNA病毒能以RNA为模板合成DNA，并发现了催化此过程的酶。图为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。请据图回答：(1)催化过程的酶是_。(2)过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达9095时才能完成，说明DNA分子具有_性。(3)由图中信息分析可知，催化过程的酶都是_，两者在作用特性上的区别是_。(4)江苏有一道凉菜白斩鸡，鸡肉嫩而不韧、味美鲜香。其加工过程中添加了从木瓜中提取的酶制成的“嫩肉粉。”下列有关嫩肉粉的叙述中，正确的是()A“嫩肉粉”可能是通过催化细胞间的纤维素水解而实现“嫩肉”的B与高温蒸煮相比，“嫩肉粉”是通过降低反应活化能而实现“嫩肉”的C“嫩肉粉”应在蒸煮鸡肉时加入，才能实现“嫩肉”D“嫩肉粉”是一种化工产品，不利于人体健康，实际应用中能少则少、能无则无【解析】由题图可知，RNADNA为逆转录过程，需要逆转录酶。都是DNA复制过程，需要DNA聚合酶。PCR扩增使用的某些酶具有耐高温的特性。嫩肉粉中含有木瓜蛋白酶等。【答案】(1)逆转录酶(2)稳定(3)DNA聚合酶催化过程的酶耐高温(4)B
