1、基因工程1科学工作者将某种海蜇的DNA分子上一段长度为5 170个碱基对的片段绿色荧光蛋白基因，转入到夹竹桃细胞中，培育出一种夜间发光的夹竹桃。培育过程如图所示，回答有关问题。(1)构建图中的重组Ti质粒，还需用到的基因工程基本工具是_。作为受体农杆菌应_，以方便筛选已导入重组Ti质粒的受体农杆菌。在将重组Ti质粒转入农杆菌之前，先要用Ca2处理农杆菌，其目的是使其成为_细胞。(2)图中将绿色荧光蛋白基因导入夹竹桃细胞的方法称为_。转基因夹竹桃幼苗对青霉素_(填“具有”或“不具有”)抗性，原因是_。(3)绿色荧光蛋白基因含有_，因此在农杆菌细胞中不能正常表达，而在夹竹桃细胞中能正常表达。解析(
2、1)构建图中的重组Ti质粒，还需用到的基因工程基本工具是限制性核酸内切酶(或限制酶)、DNA连接酶。由于Ti质粒上含有抗青霉素基因，故作为受体农杆菌应不含抗青霉素基因(或对青霉素敏感)，以便根据质粒上的标记基因筛选导入重组质粒的农杆菌。在将重组Ti质粒转入农杆菌之前，先要用Ca2处理农杆菌，其目的是使其成为感受态细胞，易于吸收周围环境中的外源DNA分子。(2)图示中将绿色荧光蛋白基因导入夹竹桃细胞的方法称为农杆菌转化法。根据图示可知目的基因插入在了质粒上的TDNA片段，由于TDNA可转移至受体细胞并且整合到受体细胞的染色体DNA上，所以插入在TDNA中的目的基因被导入夹竹桃细胞并整合到了染色体
3、DNA上，而抗青霉素基因没有进入夹竹桃细胞，故转基因夹竹桃幼苗对青霉素不具有抗性。(3)绿色荧光蛋白基因来自真核生物，含有内含子，转录后需要将内含子转录的部分在细胞核进行剪切，而农杆菌为原核生物，不具备该剪切功能，因此在农杆菌细胞中不能正常表达，而在夹竹桃细胞中能正常表达。答案(1)限制性核酸内切酶(或限制酶)、DNA连接酶不含有抗青霉素基因(或对青霉素敏感)感受态(2)农杆菌转化法不具有农杆菌(或重组Ti质粒)中只有TDNA才能进入夹竹桃细胞，而抗青霉素基因没有进入夹竹桃细胞(3)内含子2人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产
4、Y。回答下列问题。(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取_作为模板，在_催化下合成cDNA，再利用_技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的_中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_。(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是_。解析(1)由于人的T细胞可以产生蛋白
5、质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的
6、蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。答案(1)mRNA逆转录酶PCR(2)TDNA整合到叶肉细胞染色体DNA上(3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基3烟草是有重要经济价值的双子叶植物，易受TMV(烟草花叶病毒)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TM感染。研究人员利用转基因技术培育出了抗TM烟草，操作流程如图所示。(1)表示遗传信息流动中的_过程，所需原料为
7、_。过程所需要的工具酶是_。(2)大量扩增目的基因可以使用PCR技术，该技术包括变性、退火、延伸三个步骤，变性这一步骤的目的是_。(3)过程最常用的方法是_，过程用到的细胞工程技术是_。(4)过程还需要进行基因工程操作步骤中的_，其中，在个体水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是_。解析(1)表示以RNA为模板逆转录形成DNA的过程，所需原料为DNA的单体：4种脱氧核苷酸。过程构建基因表达载体的过程需要用同种限制酶切割目的基因与运载体，用相同的DNA连接酶连接目的基因与运载体的末端。(2)PCR技术中的变性是利用高温使DNA发生变性，解旋形成单链。(3)过程将目的基因导入植物体细胞的方法常用
8、农杆菌转化法，过程受体细胞通过植物组织培养技术得到再生植株。(4)过程从再生植株中筛选成功转基因的抗TMV烟草植株还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定；其中，若从个体水平鉴定获得的烟草能否抗TMV，可通过接种烟草花叶病毒的方法来确定。答案(1)逆转录四种脱氧核苷酸限制酶和DNA连接酶(2)使DNA解旋为单链(DNA解旋)(3)农杆菌转化法植物组织培养(4)目的基因的检测与鉴定用TMV感染烟草，观察烟草是否被感染(患病)4国际水稻研究所人员从产量低的耐淹水稻中找到一种耐淹基因，将其移入到高产热带水稻中，终于培育出耐淹的高产水稻品系，其产量比高产热带水稻产量还要高。耐淹基因移入的方法
9、可通过转基因技术实现。请回答下列相关问题：(1)为培育耐淹的高产水稻品系，应需将耐淹基因进行体外扩增。在PCR反应体系中加入了热稳定DNA聚合酶、引物等，还加入耐淹基因作为_，加入_作为合成DNA的原料。(2)质粒常被用作运载体，因为质粒具有_(答2点即可)。构建耐淹基因的质粒表达载体时，常用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，目的是_。(3)根据耐淹基因表达的蛋白质，研究人员通过对它的氨基酸序列设计并人工合成耐淹基因。与水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在结构上缺少了_。虽然两种基因转录的产物不同，但最终表达出相同的蛋白质，可能原因是_。(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，
10、必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质的原因是_。解析(1)利用PCR技术在体外扩增耐淹基因(目的基因)时，在PCR反应体系中除了加入热稳定DNA聚合酶、引物等外，还加入耐淹基因作为模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)作为合成DNA的原料。(2)质粒被用作运载体，应具备的条件有：能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切位点，方便剪切；具有标记基因，便于检测和筛选。构建耐淹基因的质粒表达载体时，用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，可以减少耐淹基因及质粒的自身环化、使耐淹基因定向连接到质粒上，以增大耐淹基因正向(正确)连接的概率。(3)根据耐淹基因表
11、达的蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA分子中，缺乏与基因中的启动子、终止子和内含子相对应的碱基序列。由于密码子具有简并性，虽然两种基因转录的产物不同，但最终能够表达出相同的蛋白质。(4)由于直接改造的蛋白质不能遗传，而改造基因易于操作且改造后能够遗传，所以在蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质。答案(1)模板dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)(2)能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切位点，方便剪切；具有标记基因，便于检测和筛选(答2点即可)减少耐淹基因及质粒的自身环化、增大耐淹基因正向(正确)连接的概率(3)启
12、动子、终止子和内含子密码子具有简并性(4)改造基因易于操作且改造后能够遗传5CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是近年来颇受关注的一项新技术。该基因表达系统主要包含引导RNA和Cas9蛋白两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图用CRISPR/Cas9系统对水稻产量基因Q基因进行编辑，请回答下列问题：(1)研究发现，CRISPR/Cas9仅存在于原核生物，故需借助_技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9蛋白与_酶的功能相似。(2)首先依据_的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA)，再
13、将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。位点、位点分别表示_酶切位点。(3)质粒B大小为2.5 kb(位点与位点相隔60 b)，经酶切后的片段A大小为0.5 kb(千碱基对)，连接形成的表达载体大小为_kb。(4)常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的_上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到_，从而使其得以维持稳定和表达。(5)CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，试从引导RNA的角度分析脱靶的原因_。解析(1)根据题干信息“Cas9
14、蛋白结合到相应位置并剪切DNA”，说明Cas9蛋白与限制酶的功能相似。(2)由于是对水稻产量基因Q基因进行编辑，故首先需要依据Q基因的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA)，再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。根据片段A两端的限制酶种类以及片段A连接在位点、位点之间，可知位点、位点分别表示Kpn和BamH的酶切位点。(3)质粒B大小为2.5kb(位点与位点相隔60 b)，经酶切后的片段A大小为0.5 kb(千碱基对)，连接形成的表达载体大小为2.50.50.062.94 (kb)。(4)常用农杆菌转化法
15、将目的基因导入水稻受体细胞，由于农杆菌的Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故可将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到水稻细胞染色体的DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。(5)由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合，从而导致CRISRP/Cas9基因编辑技术会出现编辑对象出错而造成脱靶。答案(1)转基因(DNA重组或基因工程)限制(2)Q基因Kpn、BamH(3)2.94(4)TDNA水稻细胞染色体的DNA上(5)其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合
16、而脱靶6为探究M基因的功能，科研人员将克隆得到的M基因导入拟南芥植株(自交繁殖)，流程图如图所示，回答下列问题：(1)通过过程a、b，采用_法来获得了大量的M基因，过程b中需先加热至9095 然后冷却至5560 ，冷却的目的是_。(2)为了获得转基因植物，采用_法侵染拟南芥的花序。其基本过程如下：过程d：将重组质粒导入大肠杆菌，其目的是_。过程e：将重组质粒导入农杆菌，再将含有重组质粒的农杆菌离心、富集，得到含有M基因的农杆菌液。过程f：在拟南芥植株产生大量花序时，将其花表面部分在农杆菌悬浮液中浸泡2030 s,34周后对转化拟南芥植株收种子(T0)，浸泡之前，需先剪去已经长成的角果(这些角果
17、将来发育成种子)，原因是_。将收获的拟南芥种子T0，播种在含有_的培养基上，能健康生长的幼苗含有_。(3)采用农杆菌花序侵染的方法转化，一般只能将目标片段整合到一条DNA上，若要获得M基因稳定的突变体，需_筛选出能稳定遗传的突变体。解析(1)图示中由已知RNA获取目的基因的方法是反转录法(逆转录法)，对目的基因进行扩增采用的是PCR技术。进行PCR时需加热至9095 然后冷却至5560 ，冷却的目的是使引物结合到互补DNA链上。(2)图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是利用大肠杆菌的增殖来获取大量重组质粒(让目的基因扩增)。适合转化植株的花卉应没有成
18、熟，也没有产生已受精的角果。因为这些已受精的角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低转化率，不利于后续操作。由于质粒中含有卡那霉素抗性基因，成功转入重组质粒的种子能够在卡那霉素培养基上正常生长，非转基因种子不能正常生长，一般萌发后死亡。(3)由于农杆菌介导的花序侵染法一般只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为筛选出能稳定遗传的突变体，可将T0代连续自交。答案(1)反转录法(或逆转录法)和PCR使引物结合到互补DNA链上(2)农杆菌转化获取大量重组质粒(让目的基因扩增)这些已受精的角果将来结的种子是非转基因的卡那霉素M(目的)基因(3)T0代连续自交7人参是珍贵的药用植物，研究人
19、员运用转基因技术构建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞表达系统，为珍贵药用植物与疫苗联合应用开辟了新思路，其构建过程如图所示，图中Sma、Sst、 EcoRV为限制酶。请回答相关问题：(1)的构建过程除限制酶外还需要_酶；想要从中重新获得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoR 或Sma，原因是_。(2)将重组质粒转入农杆菌常用_处理细胞；要使目的基因成功整合到人参细胞的染色体上，该过程所采用的质粒应含有_。(3)分析图可知，中应含有的标记基因是_；过程的目的是_。(4)研究人员将HBsAg基因表达蛋白上的某位点氨基酸进行替换，通过一定的方法获得了新HBsAg基因，进而获得了免疫效应更
20、强的疫苗，请按照蛋白质工程的原理写出获得新HBsAg基因的基本途径_。解析(1)图中为重组质粒，其形成时需要限制酶和DNA连接酶的参与；据图分析可知，EcoR V、Sma切割后得到的是平末端，然后用DNA连接酶连接后，所形成的重组序列不能再被EcoR V和Sma识别，因此想要从中重新获得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoRV或Sma。(2)将目的基因导入农杆菌等微生物的方法是用钙离子处理细胞；农杆菌的质粒中含有一段可以转移的DNA，即TDNA，它能将目的基因成功整合到人参细胞的染色体上。(3)过程中是将受体细胞放入含氨苄青霉素的培养基中培养，以筛选出含有HBsAg基因的人参细胞，因此中应
21、含有的标记基因是氨苄青霉素抗性基因。(4)据题意可知，按照蛋白质工程设计实验的过程为从HBsAg基因表达蛋白的功能出发设计HBsAg基因表达蛋白的结构将HBsAg基因表达蛋白上的某位点氨基酸进行替换找到并改造HBsAg基因的脱氧核苷酸序列。答案(1)DNA连接两平末端连接后的重组序列不能再被EcoR V和Sma识别(重组质粒无这种限制酶的识别序列)(2)钙离子(Ca2)TDNA(3)氨苄青霉素抗性基因筛选出含有HBsAg基因的人参细胞(4)从HBsAg基因表达蛋白的功能出发设计HBsAg基因表达蛋白的结构将HBsAg基因表达蛋白上的某位点氨基酸进行替换找到并改造HBsAg基因的脱氧核苷酸序列8
22、P450是石油降解的关键酶，用Sal和Nde联合酶切获得的P450基因，与如图所示的质粒(pCom8)重组，导入土著菌种Y9，获得了基因工程菌P450/Y9。图中mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的菌落变成黑色，aacCl是庆大霉素(一种抗生素)抗性基因，限制酶Nde、Xho和Ssp在原质粒上均只有一个酶切位点。如图表示几种限制酶的识别序列和切割位点，据图回答下列问题：(1)构建pCom8重组质粒时，需用_(限制酶)对图示质粒进行处理，才能与_在DNA连接酶的作用下形成重组质粒。(2)为了扩增重组质粒，需将其转入用_预先处理的土著菌种Y9中，提高质粒导入率，以便获得更多基因工程菌P450/
23、Y9。为了筛选出转入了重组质粒的基因工程菌P450/Y9，应在筛选平板培养基中添加_作为载体的质粒除了含有标记基因，还应该含有_(至少写两个)。(3)为检测基因工程菌降解石油能力的大小，可观测的指标是_。土著菌种Y9不能降解石油，但转入上述构建好的表达载体后则获得降解石油的能力，这是因为_。解析(1)根据题干信息已知，切割目的基因的限制酶是Sal和Nde，而pCom8上无Sal的切割位点，又因为如图显示Sal和Xho切割后露出的黏性末端是相同的，因此可以用Nde、Xho切割质粒，然后与目的基因在DNA连接酶的作用下形成重组质粒。(2)为提高质粒导入率，土著菌种Y9预先需用Ca2处理。因为Xho
24、切割质粒会破坏标记基因mel，而aacCl未破坏，因此为了筛选出转入了基因工程菌P450/Y9，应在筛选培养基中加入庆大霉素。质粒具备的特点有：含有标记基因、启动子、终止子、复制原点、自我复制等。(3)为检测基因工程菌降解石油能力的大小，可在一定时间内观测所取样品石油的剩余量。P450是石油降解的关键酶，转入表达载体后，P450基因得以表达，即基因工程菌P450/Y9可分泌降解石油的P450酶。答案(1)Nde、Xho目的基因(或P450基因)(2)Ca2(或CaCl2)庆大霉素启动子、终止子、复制原点(答出两点即可)(3)2天后(或一定时间后)样品中石油的含量(剩余量) 基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶(答案合理即可)
