1、考纲要求展示知识内容要求蛋白质的提取和分离PCR技术的基本操作和应用知识网络构建一、DNA的粗提取与鉴定1.提取原理：DNA与杂质的_不同，DNA与杂质对酶、高温、洗涤剂的_不同。2.实验流程(1)材料的选取：选用DNA含量相对_的生物组织，如鸡血、菜花、洋葱等。(2)破碎细胞：鸡血细胞，加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，用_过滤，收集滤液。(3)去除杂质：利用DNA在不同浓度的_溶液中溶解度不同，通过控制该溶液的浓度去除杂质。(4)DNA析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的_溶液(体积分数为_%)(5)DNA的鉴定：DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入4 mL的_，沸水中
2、加热5 min，溶液变成_。二、多聚酶链式反应扩增DNA片段1.PCR原理加热80100，双螺旋结构解体,缓慢_，分离的DNA链又重新结合2.PCR反应过程(1)变性：当温度上升到_以上时，双链DNA解聚为单链。(2)复性：温度下降到_左右时，两种_通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸：温度上升到_时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在_酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。三、血红蛋白的提取和分离实验1.样品处理：红细胞洗涤_释放分离血红蛋白溶液2.粗分离：用_法除去血红蛋白溶液中相对分子质量_的杂质3.纯化：用_法分离相对分子质量不同的蛋白质【自我校对】一、
3、1.溶解度 耐受性 2.1较高 2纱布 3NaCl4酒精 95 5二苯胺试剂 蓝色二、1.冷却 2.190 250 引物 372 DNA聚合三、1.血红蛋白 2.透析 较小 3.凝胶色谱DNA的粗提取与鉴定一、DNA与蛋白质理化性质的区别DNA蛋白质蛋白酶没影响水解高温80以上才会变性6080会变性洗涤剂没影响瓦解细胞膜(破坏膜中的蛋白质分子)二、实验设计流程制备鸡血细胞液(加柠檬酸钠，静置或离心)破碎细胞，释放DNA(加蒸馏水，沿同一方向快速搅拌)过滤，除去细胞壁、细胞膜等溶解核内DNA(加入NaCl至2 mol/L，同一方向缓慢搅拌)DNA析出(加蒸馏水至NaCl浓度为0.14 mol/L
4、，过滤，再溶解到2 mol/L的NaCl溶液中)除去细胞质中的大部分物质DNA初步纯化(与等体积95%冷却酒精混合，析出白色丝状物)除去核蛋白、RNA、多糖等DNA鉴定(二苯胺，沸水浴，呈现蓝色)NaCl酒精(体积分数为95%的冷酒精)DNA不溶蛋白质NaCl溶液从2 mol/L逐渐稀释的过程中溶解度逐渐增大某些蛋白质可溶【例1】下表是关于“DNA粗提取与鉴定”实验中所使用的材料、操作及其作用的表述。正确的是()试剂操作作用A柠檬酸钠溶液与鸡血混合防止血液凝固B蒸馏水与鸡血细胞混合保持细胞形状C蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl中加速DNA的溶解D冷却的酒精加入到过滤后DNA的NaCl中产生特
5、定的颜色反应【解析】在“DNA粗提取与鉴定”实验中，柠檬酸钠可防止血液凝固；向鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜破裂；DNA在不同的氯化钠溶液中的溶解度不同，在0.14 mol/L时，溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些物质可以溶于酒精，所以加入酒精可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺产生蓝色反应(需要水浴加热)。【答案】A1.实验中共3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要收集其滤液，使用的纱布为12层，第2次要收集其滤出的黏稠物，使用的纱布为多层。2.实验中有6层搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解
6、和提取中，各步搅拌均要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，以防止DNA分子断裂。3.实验中有两次使用蒸馏水。第一次加蒸馏水是为了使血细胞吸水膨胀破裂；第二次加蒸馏水是为了稀释NaCl溶液使DNA析出。4.用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度的溶解使DNA析出，能除去不能溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。5.最后析出DNA必须使用冷酒精(至少在5以下存放24小时)，并且将1份含DNA的NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少，可将混合液放入到冰箱中再冷却几分钟。1.(改编)在DNA
7、分子的粗提取实验中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA 【解析】在该实验过程中，第一次加入蒸馏水的目的是使血细胞吸水而破裂，以使核物质溶解。第二次加入蒸馏水是为了降低NaCl溶液的浓度至0.14 mol/L，因为此时的DNA溶解度最小，可使DNA析出。【答案】B PCR扩增技术一、PCR相关技术原理与条件1.PCR：多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。2.引物：是一小段RNA单链或单链DNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。
8、3.扩增方向：DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。4.解旋：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。5.酶：耐高温的TaqDNA聚合酶，高温不会失活。6.PCR的条件：一定的缓冲溶液下才能进行，需提供DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时要控制温度。二、过程1.变性：当温度上升到90 以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：2.复性：温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：3.延伸：温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：三、结果1.PC
9、R一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。3.两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。(1)DNA聚合酶的特性，只从DNA的3端开始延伸DNA链，而不能从头合成，故DNA复制需引物。(2)子链的延伸从引物3端开始，所以DNA的合成方向是子链的5端3端。【例2】关于DNA的复制，下列叙述正确的是()A.DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的5端延伸DNA 链B.DNA 复制不需要引物C.引物与DNA 母链通过碱基互补配对进行结合D.DNA 的合成方向总是从子链的3端向5端延伸【解析】由于DNA 聚合酶只能从引物的3端延伸DNA 链；由于DNA 分子是反向平行的
10、，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA 聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5端向3端延伸。【答案】C生物体内的DNA复制与PCR反应的区别体内复制PCR解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90，双链全部解开，不需解旋酶特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行2.下列有关PCR 描述，不正确的是()A.是一种酶促反应B.引物决定了扩增的特异性C.扩增理论产量按y(1X)nD.扩增对象是氨基酸序列【解析】PCR是一种体外
11、迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原料，在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y(1X)n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。【答案】D血红蛋白的提取和分离一、蛋白质分离的依据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来提取和分离不同种类的蛋白质。二、血红蛋白的提取和分离方法1.凝胶色谱法相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。相对分子质量较大的蛋白质无
12、法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。2.电泳法利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异和分子本身大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。三、实验操作程序1.样品处理(1)红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化；(2)血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来；(3)分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。2.粗分离(1)原理：透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内，透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质。(2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中
13、，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12小时。透析袋是用硝酸纤维素制成。3.纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。4.纯度鉴定：一般用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。【例3】在蛋白质的提取和分离中，对于样品的处理过程的分析正确的是()A.洗涤时离心速度过高，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果B.洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐C.洗涤过程中用0.1%的生理盐水D.透析的目的是去除样品中相对分子质量较大的杂质【解析】洗涤红细胞的目的是去除表面的蛋白质，该过
14、程中要用0.9%的生理盐水，而透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。【答案】ADNA与蛋白质提取的比较 提取 物质 提取 方法 提取原理 步骤 DNA 盐析法(1)在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同(2)不溶于酒精，但某些化合物溶于酒精(1)溶解在2 mol/L的NaCl溶液中(2)NaCl溶液中加水稀释0.14 mol/L，使DNA析出、过滤(3)加入冷酒精析出 血红蛋白 凝胶色谱 法，电泳法(1)根据相对分子质量的大小(2)各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、性状的不同(1)样品处理(2)粗提取(3)纯化(4)纯度鉴定 3.(2009江苏高考T23)下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的是()A.提取细胞中的DNA和蛋白质都仅用蒸馏水涨破细胞B.用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA不能去除蛋白质C.蛋白质提取和分离过程中进行透析可以去除溶液中的DNAD.蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化【解析】提取动物细胞中的DNA才要用蒸馏水涨破细胞，提取蛋白质要用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂；蛋白质提取和分离过程中进行透析可除去相对分子质量较小的杂质，而将大分子保留在袋内。【答案】D
