1、微生物的利用大肠杆菌的分离和培养酶的应用果汁中的果胶和果胶酶加酶洗衣粉的使用条件和效果-固定化酶的使用条件和效果生物技术在食品加工中的应用泡菜的腌制和亚硝酸的测定果酒和果醋的制作浅尝现代生物技术植物组织培养实验名称涉及的生物或物质 来源大肠杆菌的分离和培养大肠杆菌斜面上的菌种果汁中的果胶和果胶酶果胶酶黑曲霉或苹果青霉加酶洗衣粉的使用条件和效果各种酶，主要是碱性蛋白酶等微生物-固定化酶的使用条件和效果-固定化酶枯草杆菌果酒和果醋的制作 果酒:酵母菌+天然果醋:醋化醋杆菌干酵母菌种或醋曲泡菜的腌制和亚硝酸的测定假丝酵母、乳酸菌 天然微生物植物组织培养菊花实验1 大肠杆菌的培养和分离 实验目的：1.
2、进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基本进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。（一）.微生物包括五类病毒细菌放线菌真菌原生动物有些细菌在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。1个细菌细胞只形成1个芽孢。灭菌与消毒 两者要求达到的处理水平不同。消毒只要求杀灭或/和清除致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病。灭菌不仅要求杀灭或/和清除致病微生物，还要求将所有微生物全部杀灭或/和清除掉，包括非致病微生物(二)培养基1.分类(按物理形态分)(1)液体培养基(2)固体培养基常用的固体培养
3、基:琼脂固体培养基.微生物在固体培养基表面生长,可以形成肉眼可见的菌落.2.培养基内所含的基本物质(1)水(2)碳源(3)氮源(4)无机盐3.培养基内所需的其他条件(1)pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质-?如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素(3)氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件生长因子(三)无菌技术1、获得纯净培养物的关键:2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页)3、消毒与灭菌(1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？方法:a.煮沸消毒法b.巴氏消毒法:如牛奶的消毒
4、c.化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等d.紫外线消毒(不包括芽孢和孢子)防止外来杂菌的入侵火焰的外焰烧灼灭菌法：对象是接种环灭菌锅：1Kg/cm2压力 灭菌15min高压蒸汽灭菌法：对象是培养基、培养皿及其他器具摇床假设情境：从一个混合有多种细菌的群体中如何分离得到我们所需要的某种细菌菌落？液体培养基中扩增固体平面培养基上划线分离法固体斜面培养基上保存菌种平板划线接种法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌纯培养细菌接种法（斜面培养基接种法：用于培养，保存菌种）液体培养基接种法：用于增菌及鉴定细菌生长特
5、点，如表面生长，沉淀生长，均匀混浊生长等。表面生长均匀混浊生长沉淀生长P22空白斜面：将LB液体培养基配好，加入琼脂加热使之融化后，调节好pH，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管2mL，加棉塞（是否脱脂？）并将试管捆绑在一起，上端加盖一张牛皮纸（以防灭菌时，冷凝水沾湿棉塞），灭菌。灭菌后斜靠在平放的铅笔上，冷却后使培养基形成斜面。步骤:、配制培养基;培养基灭菌、器具灭菌2、冷却，倒平板 (编号,无菌环境操作)3、接种到液体培养基(目的:扩大培养)(无菌环境操作)、划线分离、恒温培养箱培养1224h(无菌环境操作)、接种斜面,4冰箱保存(目的:为了保存菌种)6、实验完成后，接触过细菌的器皿均应灭菌处
6、理后丢失。1.配制培养基并灭菌，器具灭菌在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。如使用高压锅灭菌，则有压力后开始计时灭菌15min。灭菌锅：1Kg/cm2压力 灭菌15min高压蒸汽灭菌法：对象是培养基、培养皿及其他器具2.冷却倒平板：灭菌后，待高压锅或灭菌锅压力与大气压相同时（即没有压力）打开锅盖。将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上，打开超净台的紫外灯和过滤风（注意：紫外灯打开后人必须离开），待固体培养基冷却到60时（手放上还有些热的时候），关闭紫外
7、灯，用镊子夹出酒精棉球擦手。在酒精灯旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他3个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶中的培养基倒在培养皿里。将培养基分别倒至4个培养皿中，每倒入一个后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满皿底部，待凝，使之形成平面。倒平板技术倒平板技术3.接种到液体培养基（目的：扩大培养大肠杆菌）。完成后三角瓶在37摇床振荡培养12h。将大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶（之前已完成灭菌）放在左手中，靠近酒精灯火焰；右手拿着接种环，并用右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜，将接种环在火焰上灼烧，再深入到斜面，使环接触培
8、养基冷却后，再取菌体。将菌体放入三角瓶的液体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。三角瓶在37 摇床振荡培养12h。这一步骤也可由教师来完成。4.划线分离（目的：分离大肠杆菌）、37恒温培养箱培养12-24h（注意：培养时，要将培养皿倒置）在酒精灯火焰上灼烧接种环，将摇床上培养12h的菌液打开，接种环部分深入到菌液中。然后，在固体培养基的平板上连续划线，接种环只在菌液中蘸菌液一次，划线后盖好培养皿。将培养皿倒置（盖子在下面），放到37 恒温培养箱中培养12-24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已分离。以及课本的图资料第3页菌落：单个细菌用肉眼是看不见的，当单个或少数细
9、菌在固体培养基上大量繁殖时，便会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征。主要用于微生物的分离、纯化、鉴定、计数等研究和选种、育种等工作。有荚膜的细菌：光滑无荚膜细菌的：表面粗糙菌落特征菌落细菌的菌落特征因种而异5.接种斜面，4冰箱保存。在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37恒温培养箱培养24h后，4冰箱保存。6.实验完成后，接触过细菌的器皿均应灭菌处理后丢弃。目的：为了防止实验菌残留于接种环而污染环境和感染实验人员。视频1为了获得纯净的培养物，其关键是防止外来杂
10、菌的入侵污染：1）培养皿；2）培养基；3）接种过程是无菌的2请思考：培养基、培养皿、手、接种环分别如何消毒或灭菌？3.如何从混合的细菌中分离得到以石油为碳源的细菌？4.涂布分离法与划线分离法的比较课本P205.如何培养霉菌（属于真菌）？课本P21课后练习1如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？1)胆大心细，操作快捷；2)注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时间，对污染源的改善要考虑周到；3）注意微生物生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜37摄氏度的温度；而霉菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜25-30摄氏度
11、的温度。2.在培养后如何判断是否有杂菌污染？1）从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等等，是区别细菌、放线菌和霉菌的关键指标；2）用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌的关键指标；3）上述方法较难区分同类的不同物种，需要借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察有无鞭毛、孢子形态、孢子着生方式、芽孢、毒素及特异生理生化性质等。课后练习3见练习第2页课后练习4：实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害杂菌污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影
12、响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压蒸汽灭菌后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤30min，再用清水洗净，仍可再用。练习5：如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通大肠杆菌污染？转基因的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是通过改造的通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨苄青霉素基因。转基因载体（质粒）转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养中生长，而未被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保证了转基因工程菌的纯洁性。在获得转基因工程菌后，如果为了选择高表达菌株进行分离，也可使用含抗生素的培养基，这就保证了转基因工程菌不能被普通（无抗性基因）的大肠杆菌污染。
