1、第一章无菌操作技术实践一、微生物的培养1.培养基(1)概念：为人工培养微生物而制备的，提供适合微生物_或积累_的营养基质。(2)种类：按照物理状态可分为：_培养基、半固体培养基和_培养基。按化学成分可分为：_、合成培养基和半合成培养基。按功能可分为：基础培养基、_、鉴别培养基等。生长、代谢产物液体固体天然培养基选择培养基繁殖2.无菌操作与接种技术_(1)灭菌的方法 干热灭菌_：如高压蒸汽灭菌法(2)无菌操作与接种技术：无菌操作微生物接种技术的关键：a.培养基、试管、培养皿、接种器械在接种前都需要_。b.操作人员及操作环境要求_。灼烧灭菌湿热灭菌灭菌消毒划线接种_斜面划线法：主要用于试管中的_涂
2、抹平板接种涂抹平板法：用无菌玻璃刮铲将_涂在培养基表面混合平板法：将菌种混合于培养基中_穿刺接种用_的接种针垂直刺入培养基后拔出接种技术：平板划线法交叉划线菌种斜面培养基倒平板带有菌种3.培养基的配制(1)配制原则：为所培养微生物的_提供所需的_。(2)配制过程：配制培养液_分装包扎灭菌_。【点拨】灭菌可杀死所有微生物，消毒只杀死微生物的营养细胞，常用的消毒方法有70%的酒精消毒、紫外线消毒等。生长和繁殖营养物质和条件搁置斜面调节pH二、微生物的分离与计数1.微生物的分离(1)原理：根据微生物对_等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的必需条件，或加入_使非目的微生物不能生长，从而达到_的目的
3、。(2)鉴定依据：_的特征。涂抹平板法(3)方法：平板分离法_平板划线法营养成分、氧气、pH某些抑制剂选择分离微生物菌落或菌苔混合平板法2.微生物的数量测定【点拨】微生物计数培养时常设置对照实验：(1)判断培养基是否有杂菌污染，可将未接种的培养基同时进行培养；(2)判断选择培养基是否有筛选作用，可设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养。种 类特 点用 途选择培养基培养基中加入某种化学物质，用来抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养和分离出特定微生物(如分离酵母菌和霉菌，可以在培养基中加入青霉素)鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物
4、，如用伊红-美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色并带有金属光泽)培养基的配制和无菌操作1.培养基的种类2.涂抹平板法和混合平板法的异同(1)过程如图：(2)结果不同：涂抹平板法：细菌菌落通常仅在平板表面生长。混合平板法：细菌菌落出现在平板表面及内部。(3)目的相同：分离各种目的微生物。3.常见的消毒和灭菌方法内容种类主要方法应用范围灭菌灼烧灭菌法酒精灯火焰灼烧接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或瓶口等高压蒸汽灭菌法121维持15 min30 min培养基及多种器材、物品干热灭菌法干热灭菌箱160170加热1h2h玻璃器皿、金属用具等凡不适合
5、用其他方法灭菌而又能耐高温的物品内容种类主要方法应用范围消毒巴氏消毒法7075煮30 min或80煮15 min牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体煮沸消毒法100煮沸5 min6 min日常食品、罐装食品紫外线消毒法紫外线照射30 min接种室、接种箱等化学药物消毒法用体积分数为70%75%的酒精、碘酒涂抹，来苏水喷洒等用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒、手术器械、塑料或玻璃器皿等【典例训练】(2011新课标全国卷)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染，某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_为惟一
6、碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于_培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即_和_。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力_。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、_和_。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。【解题指南】1.考查实质：本题以筛选菌株为情境考查培养基的配制、接种方法、无菌技术等知识点。2.解题关键：熟悉微生物操作的基本原理、基本技术和操作流程，明确无菌技术的要素。【解析】实验目的是为了筛选出可以分解原油的高效菌株，因此在筛选的时候
7、选择培养基的碳源为原油。纯化分离微生物的方法有3种：平板划线法和涂抹平板法、混合平板法；灭菌的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌。答案：(1)原油选择(2)平板划线法涂抹平板法(或混合平板法)(3)强(4)干热灭菌湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)火焰微生物的分离、培养和数量测定1.筛选菌株(1)原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。(2)菌株筛选原理的比较：土壤中分解尿素的细菌分解纤维素的微生物选择培养基的成分尿素作为惟一的氮源纤维素作为惟一的碳源鉴定方法在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，
8、当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈2.统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法：原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)：原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数=(CV)M，其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性
9、。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。【技巧点拨台】选择培养基的选择方法(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。(2)改变培养基中的营养成分。例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为惟一碳源时，可以分离出消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。下面是探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数的实验，完成下列问题：实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土壤制成的稀泥
10、浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离。材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛有9 mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛有90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。(1)方法步骤：倒平板：分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在_操作。制备土壤稀释液：取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至盛有9 mL的无菌水的试管中，依次稀释到107稀释度。涂布：按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下
11、，无氮培养基应至少涂布_个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布_个。培养：放入恒温箱内，在28 30 下培养3d4d。细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在_的平板进行计数。如果测定的平均值为50，则每克样品中的菌落数是_。(稀释度是105)(2)预期结果：相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数_(填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。原因是_。【解题指南】1考查实质：本题通过探究实验的过程考查微生物的培养、分离和计数等知识点。2解题关键：明确涂抹平板法的操作过程，学会根据计算结果得出相关的结论。【解析】在酒精灯火焰旁倒平板，可以减少杂菌污染。为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落
12、数在30300的平板进行计数，并取平均值，则每克样品中的菌落数为(500.1)105=5107。牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，以消除无关变量对实验结果的影响，该培养基适合其他细菌生存，所以，它比无氮培养基上的菌落数目多。答案：(1)酒精灯火焰旁 3 130300 5107(2)多于无氮培养基上只有土壤中的自生固氮菌生存繁殖，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存1.下表是几种微生物能利用的碳源和氮源物质的描述，其中描述错误的微生物有几种()A.1种B.2种C.3种D.4种硝化细菌圆褐固氮菌甲烷氧化菌乳酸菌碳源物质CO2CO2葡萄糖葡萄糖氮源物质NH3N2尿素N2【解析】选C。硝化细菌属
13、于化能自养型生物，以CO2为碳源，以NH3为氮源。圆褐固氮菌属于异养固氮菌，碳源为含碳有机物，氮源为分子态氮。甲烷氧化菌对碳源要求严格，只能是甲烷或甲醇。乳酸菌属于异养厌氧型菌，其碳源和氮源均为有机物。2.无菌操作技术是微生物培养及植物组织培养的关键环节之一，其中高压蒸汽灭菌法是最常用的灭菌方法之一，与其他灭菌方法相比，高压蒸汽灭菌法具有()A.与干热灭菌相比较，高压蒸汽灭菌属于湿热灭菌，其效果不如干热灭菌B.与消毒技术相比较，高压蒸汽灭菌是用较温和的方法杀死物体内外的绝大多数微生物C.培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌D.高压蒸汽灭菌会产生大量水蒸气，热产量大，不易于热量传递【解析】选C。高压
14、蒸汽灭菌属于湿热灭菌，与干热灭菌相比，效果好，这是因为水蒸气热产量大、热量易于传递；同时与消毒相比，灭菌则是采用强烈的物理或化学方法杀灭物体内外所有的微生物。3.(2012杭州模拟)产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是()A.一个细菌、液体培养基B.许多细菌、液体培养基C.一个细菌、固体培养基D.许多细菌、固体培养基【解析】选C。菌落是由一个或几个细菌在固体培养基上生长繁殖后形成的细菌集合体。4.如表表示在不同培养基中细菌的生长繁殖情况(A、B、C、H、I、J、K、M为培养基的成分，“+”表示生长，“-”表示不生长)。请分析细菌不能合成下列哪种物质()A.HB.IC.KD.M培养基成
15、分A、B CA、B、C I、MA、B、C H、KA、B、C M、JA、B、C I、KA、B、C H、JA、B、C K、M生长状态【解析】选C。从能进行细菌培养的三组培养基中看出，它们共同含有K，且其他不能进行细菌培养的培养基中都不含K，故所培养的细菌不能合成K。5.下列说法不正确的有()A.从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比，最主要的实验条件差别是保证无氧环境B.用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少C.提取和分离纤维素酶的过程中，为了避免外界酸和碱对酶活性的影响，需向提取液和分离液中添加缓冲溶液D.若探究纤维素酶活性的最适温度，可设置不同的温度梯度进行空白对照【解析】
16、选D。牛胃是一个无氧的环境，所以其中的纤维素分解菌与需氧型醋酸菌培养条件有所不同。因是活菌计数，所以部分死亡菌无法计数。另外当菌落重合时，只能计为一个菌落，所以比实际数目少。探究最适温度可设置一系列的温度梯度相互对照，其他无关变量要适宜。6.三个培养皿中分别加入10 mL不同的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。培养36小时后，计算菌落数，结果如表。下列选项正确的是(多选)()培养皿培养基成分菌落数琼脂、葡萄糖35琼脂、葡萄糖、生长因子250琼脂、生长因子0A.该实验采用的是液体培养基B.该实验采用涂抹平板法接种C.和对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子D.和对照，说明大肠杆菌的生长需要糖类
17、【解析】选B、D。培养基中添加了琼脂是固体培养基；对大肠杆菌进行菌落计数用的是涂抹平板法；和对照不能说明生长不需要生长因子；和对照，缺少葡萄糖，大肠杆菌不能生长，说明大肠杆菌的生长需要糖类。7.氯苯化合物是重要的有机化工原料，缺点是不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案(如图1)，筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培养基配方如下表。培养基的组成液体培养基蛋白胨牛肉膏氯苯氯化钠硝酸铵无机盐(无碳)蒸馏水号10g5g5mg5g0g0g1L号0g0g50mg5g3g适量1L号0g0g20 mg80 mg5g3g适量1L(1)配制号固体培养基时，除添加号液体培养基成分外，还应添加1%的_
18、。(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是_。(3)从用途上来说，号培养基和号培养基分别属于基础培养基和_培养基。在号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是_。(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为_。(5)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的号培养基中培养，得到生长曲线(如图2)。从图2中可知SP1菌在_培养条件下最早停止生长，其原因是_。【解析】(1)固体培养基必须含有适量的琼脂。(2)为了防止杂菌污染，配制培养基时，应先调节pH，然后灭菌。(3)号培养基是为了获得更多的菌株，属于基础培养基，号培养基是为选择出SP1菌株，属于选择培养基，其中含氮物质为硝酸铵，可以为SP1菌株提供氮源。(4)当环境条件较差时，一些菌体会形成芽孢休眠体，来适应不良环境。(5)SP1菌株以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。答案：(1)琼脂(2)先调pH，后灭菌(3)选择 硝酸铵(4)芽孢(5)20 mg/L氯苯氯苯最早耗尽
