1、基于 Wnt、Notch 信号通路分析烙灸对脊髓损伤大鼠的神经修复作用岳倩文夏铂【摘 要】目的：基于 Wnt、Notch 信号通路分析烙灸对脊髓损伤后大鼠的神经修复作用。方法：将 60 只大鼠按照随机数表法分为假手术组、模型组、甲基强的松龙组、2h烙灸组、12h 烙灸组，采用改良 Allens 模型打击装置，进行急性脊髓损伤造模。甲基强的松龙组于损伤后 0.5h 给药，首次 30mg/kg，之后 5.4mg/kg 给药。2h 烙灸组、12h 烙灸组分别于损伤后 2h、12h 进行烙灸治疗。分别在造模成功后第 1d、第 7d、第 14d、第 21d 进行脊髓组织取材，利用 Westernblot
2、 进行蛋白表达量的检测。结果：在 Wnt1、Wnt3a 蛋白检测中，2h 烙灸组表达量明显低于 12h 烙灸组，差异具有统计学意义（P0.05）;2h 烙灸组的 Hes5、Presenilin1 蛋白高于 12h 烙灸组，差异具有统计学意义（P0.05）。结论：烙灸在脊髓损伤后激活 Wnt 及 Notch 信号通路，而 Wnt 与 Notch 信号通路间相互作用，可能影响烙灸治疗后相关因子的蛋白表达量。【关键词】烙灸;脊髓损伤大鼠;Wnt 信号通路;Notch 信号通路【中图分类号】R246.6【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2020）4-0026-06Effect on La
3、o Mmoxibustions with Spinal Cord Injury Rats Based on Wnt andNotch Signal PathwayYUE Qianwen XIA Bo*Ning Xia Medical University traditional Chinese Medicine faculty，Yinchuan750004，ChinaAbstract：Objective To explore the effect of Lao moxibustion on the nerverepair in rats after spinal cord injury bas
4、ed on Wnt and Notch signalingpathway.Methods The sixty rats were randomly divided into sham operationgroup，model group，methylprednisolone group，2hours Lao moxibustion group and12hours Lao moxibustion group.Allens method was used to make the rats model ofacute spinal cord injury.The western medicine
5、group was given medicineaftermanufacturing model 30 minutes，30 mg/kg for the first time，then5.4mg/kg was given.The group of manufacturing model two hours to treat Laomoxibustion，the group after manufacturing model twelve hours to treat Laomoxibustion.On the 1st，7th，14th and 21th day，the injured spin
6、al cord tissuewas taken then Using Westernblot to detect the related proteins.ResultsIn thedetection of Wnt1 and Wnt3a protein，the expression of two-hour Laomoxibustion group was significantly lower than thetwelve-hour Lao moxibustiongroupand the difference was statistically significant（P0.05）.The d
7、ifferenceof Hes5 and Presenilin1 protein in the two-hour Lao moxibustion group washigher than the twelve-hour Lao moxibustion group and the difference was ofstatistical significance（P0.05）.Conclusion Lao moxibustion were activatedthe Wnt and Notch signaling pathways after the spinal cord injury，and
8、theinteraction between the Wnt and Notch signaling pathway may affect the proteinexpression of the related factors after the Lao moxibustion treatment.Key words：Lao Moxibustion;Spinal Cord Injury Rats;Wnt SignalingPathway;Notch Signaling Pathway脊髓損伤（Spinal cord injury，SCI）是一种损害患者的脊髓结构及功能，引起运动、感觉以及自主
9、神经功能障碍或丧失的疾病。不论是采取手术治疗，还是国际通用甲基强的松龙进行冲击治疗，都存在钠潴留，水肿及尿路感染的风险1。烙灸利用温热刺激促进受损伤局部气血运行，加速体液循环，针对急性病往往有意想不到的作用。烙灸是将烙铁模具中加艾绒或者其他药物作用于损伤部位，利用烙铁作为持续温热刺激传导于皮肤上，改良了督灸继发感染率高的缺点，又给予穴位以持续温热的刺激，从而达到通经活络、消瘀散结之目的。临床上在血管性痴呆、弱少精子症、骨与关节等多种疾病中发挥着良好疗效。本研究主要采用 Allens 打击模型造成大鼠急性脊髓损伤，较好的模拟了因外力冲击等外伤所造成的脊髓受损状态。通过 Wnt、Notch 信号通
10、路，通过对脊髓损伤大鼠的 Western Blot 检测，分析烙灸疗法对脊髓损伤后大鼠的神经修复机制及是否可以促进神经干细胞增殖分化。1 材料與方法1.1 实验动物 选取清洁级 SD 大鼠 60 只（宁夏医科大学实验动物中心提供，68 周龄，体质量 220240g，雄性）。温度（25l），湿度（5010）%，光暗周期12h/12h，自由进食和饮水，常规环境适应性饲养 14d 后进行实验。1.2 主要试剂及仪器 甲基强的松龙，SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，RIPA 裂解液，缝合线、咬骨钳、一次性注射器、手术剪、组织剪等。Tanon-4200 全自动化学发光图像分析系统、低温高速离心机（TGL
11、16GA 型，上海安亭科学仪器厂）、超低温冰箱（MDF38E2 型，日本三洋公司）、电子恒温水浴锅（DZKW-4 型，北京中兴伟业仪器有限公司）、凝胶成像系统（美国 Bio-rad 公司）。1.3 脊髓损伤模型制备 实验随机选取大鼠进行称重，以 100mg/L 水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉后，置于弓形手术台，备皮消毒，取后正中线以 T10 作为中点，依次切开皮肤、筋膜、肌肉，微型咬骨钳咬合 T10 段椎板、棘突，暴露脊髓。采用改良的 Allens 打击装置，打击锤重 10g，下落高度为 5cm，致伤量为 50gcm-1（此致伤量可造成大鼠中等程度脊髓损伤）。当大鼠出现摆尾反应，双侧
12、后下肢无法移动，硬脊膜内充血或水肿，则造模成功。每日两次进行挤压膀胱排尿。本实验严格按照动物伦理审查指南进行。1.4 分组及治疗 将 60 只大鼠按照随机数表分为 5 组，每组 12 只。A 组为假手术组，只做椎管切除，不做任何处理。B 组为模型组，在造模成功过后不做治疗。C 组为甲基强的松龙组，Allens 打击 30min 后按照 30mg/kg 给药，之后按照 5.4mg/kg 给药，连续 3d。D 组为烙灸 2h 组，在脊髓损伤后 2h 进行烙灸。E 组为烙灸 12h 组，在脊髓损伤后 12h 进行烙灸。除 A 组外，各组于 Allens 打击后腹腔注射 2 万/kg 青霉素，每日 1
13、 次，连续3d，防止创面感染。术后各组予以生理盐水，连续 3d。烙灸操作：在烙灸铁质模具中放置艾绒于 D 组、E 组大鼠脊椎 T10-T11 段两侧夹脊穴（脊柱区，第 8 胸椎至第十二胸椎棘突下两侧，后正中线旁开 0.5 寸处）进行治疗（穴位定位参照实验动物针灸穴位图谱），每日 1 次，每次 5min，视皮肤发红及异常体液排出等状况而定。1.5 取材及相关指标检测1.5.1 组织取材 各组分别于造模成功后的第 1d、7d、14d、21d 进行脊髓组织提取，每组在每个时间点取 3 只，长度为损伤上下 1cm，进行 Westernblot 检测，观察脊髓Wnt3a、Wnt1、Hes1、Hes5、-
14、catenin、Presenilin1 的蛋白表达量变化。1.5.2 Western blot 检测组织研磨、RIPA 裂解液进行裂解、匀浆后离心，静置提蛋白，10%分离胶电泳、转至 PAGE 膜、5%脱脂奶粉室温封闭 1h，孵育一抗：Wnt3a 蛋白（1KG-*3/51000，Abcam 公司）;Wnt1 蛋白（1KG-*3/51000，Abcam 公司）;-catenin 蛋白（1KG-*3/55000，Abcam 公司）;Hes1 蛋白（1KG-*3/51000，Abcam公司）;Hes5 蛋白（1KG-*3/51000，Abcam 公司）Presenilin1 蛋白（1KG-*3/55
15、000，Abcam 公司）;GAPDH 蛋白（1KG-*3/53000，三箭公司）。用漂洗液洗膜 3次，孵育二抗（兔二抗 1KG-*3/53000，Jackon 公司;鼠二抗 1KG-*3/53000，Jackon 公司）放在化学发光成像仪中，曝光。1.6 数据处理 利用 Image J 软件进行灰度分析。1.7 统计学处理 采用 Grapd Prism 5.0 软件进行统计学分析，计量资料采用（xTX-*3s）表示，多组差异比较采用单因素方差分析，多个样本均数间的多重分析采用 LSD-t 检验，以 P0.05）。从-catenin 检测中可以看出，各组的蛋白表达量随着时间的损伤时间的延长均呈
16、现出下降趋势;但各组蛋白表达量均高于假手术组，表明脊髓损伤后-catenin 表达增强，提示 Wnt/-catenin 信号通路在脊髓损伤后被激活。在术后 7d 的检测中，C 组表达量高于 B 组跟 E 组;在术后 14d 检测中，D 组表达量高于 B 组跟 E 组。由此可以推断，2h 烙灸治疗有助于脊髓损伤大鼠激活-catenin 因子。在 Wnt1 的蛋白表达量中，D 组跟 E 组呈上升趋势，B 组和 C 组呈下降趋势，D 组、E组的蛋白表达量低于 B 组、C 组。术后 7d 检测中，C 组表达高于 B 组，B 组高于 E 组;在术后 14d，D 组表达量远远低于 E 组。在 Wnt3a
17、检测中，模型组蛋白表达量在上升，C、D、E 组呈下降趋势。在术后 7d 检测中，B 组大于 E 组跟 D 组;在术后 14d 检测中，B 组大于 E 组跟 D 组。提示实验中 B 组 7d、14dWnt3a 蛋白过表达。而在术后 21d 检测中，C 组表达量大于 D 组。D 组在第 14 天较之 E 组 Wnt3a 表达量低，提示脊髓损伤后内源性神经干细胞向损伤区域迁移，修复受损神经元。B 组 Wnt3a 含量最低，提示 Wnt3a 可抑制损伤后炎症反应，帮助损伤区域的神经干细胞修复。2.2 Notch 信号通路（图 4图 6）在 Hes1 检测中可以看出，各组的蛋白表达量随着时间的损伤时间的
18、延长均呈现出下降趋势。在术后 7d 检测中，C 组高于 B 组、E 组，提示增加了星形胶质细胞分化的可能性;在术后 14d 检测中 D 组表达量高于 B 组、E 组。E 组低表达说明烙灸下调 Notch 信号通路来促进其向神经干细胞分化。在 Hes5 检测中，C、D 组蛋白表达量呈下降趋势，而 B 组呈上升趋势，E 组术后 7d 与术后 14d 表达量相同。术后 7d 检测中，C 组蛋白表达量高于 B 组跟 E 组，提示增加了星形胶质细胞分化的可能性;术后 14d 检测中，D 组表达量高于 B 组、E 组;在术后 21d 检测中，D 组高于 C 组。E组低表达说明烙灸下调 Notch 信号通路
19、来促进其向神经干细胞分化。在 Presenilin1 检测中，B 组、D 组呈上升趋势，C 组、E 组呈下降趋势。在术后 7d检测中，C 组表达量高于 B 组、E 组，提示 Notch 信号通路被激活。在术后 14d 检测中，D组蛋白表达量高于 B 组、E 组，提示激活 Notch 信号通路受到抑制，D 组可能通过抑制Notch 信号通路来参与脊髓损伤的神经修复。在术后 21d 检测中，D 组表达量高于 C 组。在 Hes1、Hes5、Presenilin1 蛋白检测中，C、D、E 组间差异无统计学意义（P0.05）。在 Hes1、Hes5、Presenilin1 蛋白檢测中，12h 烙灸组明
20、显优于 2h 烙灸组。3 讨论3.1 烙灸疗法 中医学认为脊髓损伤是由于瘀血阻滞督脉，枢机统帅失职，三阳经气血逆乱而致，其病因为“瘀血”，病机为“督脉枢机不利”。沈金鳌在杂病源流犀烛谓“脊痛，督脉病也”。患者由于元阳不振，气血不调，经络堵塞造成肢体活动不利，烙灸正有此功效，它利用艾绒及器具加热所产生的温热刺激，结合腧穴组织的特点，烙烫皮肤从而激发人体体液活动禀潜能。在 Wnt、Notch 信号通路的相关因子检测中 12h 烙灸组的蛋白表达量明显优于 2h 烙灸组，提示烙灸作为一种热效应，不适合在脊髓损伤后立即应用，同时进一步明确烙灸的主要作用为活血化瘀、逐瘀生新、通经活络。烙灸始载于回回药方针
21、灸门，“要知灸的得济处，是凡一体内，多有恶润凝聚以致本体，并其禀性作坏，若人先有之，然亦不能去净，必以火灸之，则本体病根尽去”2。采用补阳还五汤配合烙灸治疗脑卒中的临床病例观察中发现患者的神经功能明显优于传统内科基础治疗组3。在乳腺增生的疾病治疗上根据月经周期以疏肝解郁为治法的中药其治疗效果远远低于中药配合增生局部烙灸组4。烙灸正是利用患者病后急需通过大量热效应和强刺激的手段，增加周围神经的敏感度，加强其与大脑中枢神经的联系。3.2 脊髓损伤的 Wnt 信号通路研究 信号通路被激活后可参与脊髓损伤后神经及损伤区域的修复。Wnt 信号通路是目前研究就最多、最透彻的信号通路。Wnt 信号通路可以刺
22、激神经干细胞的增殖并促使其向神经元分化，抑制神经干细胞向胶质细胞的分化，促进突触的再生5。从术后 7d 的蛋白表达量可以看出，在脊髓损伤早期 Wnt1 被激活后呈现高表达6。细胞凋亡、轴突再生、胶质瘢痕形成等病理现象是炎症产生的基础，DiLiddo7研究发现刺激 Wnt3a 可明显改变炎症因子激活 Wnt 信号通路抑制炎症，在 SCI 的病理过程中起到关键作用。Wnt3a 虽然可以促进轴突再生，但过表达会抑制神经干细胞的增殖而使其过早向分化为神经元8-9。本实验中模型组从术后 714d，Wnt3a 表达量不断上升达到顶峰，提示模型组 Wnt3a 存在过表达。当 Wnt/-catenin 信号通
23、路被激活，可促进神经干细胞增殖分化为神经元10，而本实验除了假手术组的-catenin 表达量不变，其余各组在损伤后-catenin 蛋白表达升高，术后 14 天 2h 烙灸组的-catenin 表达量最高，表明 2h 烙灸对脊髓损伤大鼠受损的神经干细胞中分化的过程中发挥主要作用。3.3 脊髓损伤的 Notch 信号通路研究 Notch 信号通路是神经干细胞研究中的一条极为重要的信号通路11，通过信号强度影响细胞的分化、增殖和存活。下调 Notch 信号通路会促进其向神经干细胞分化12，激活 Notch 信号通路有利于神经干细胞干性的维持13。Hes 蛋白通过调节控制神经和神经胶质特异性基因的
24、表达，来调节控制神经干细胞14。Hes1 只在神经干细胞中表达，其缺失会使神经元分化增加15-16，其高表达会促进神经干细胞的增殖，分化为星形胶质细胞抑制神经干细胞分化为神经元17。Notch 信号表达增强可能是脊髓损伤后限制神经功能再生的重要原因，抑制 Notch 信号通路活性，可以促进脊髓损伤后功能重建18。在 Hes1、Hes5 及 Presenilin1 蛋白检测中，12h烙灸组在术后 7d、14d 蛋白表达量明显低于其余各组，证实 12h 烙灸治疗抑制了 Notch 信号通路，可促进脊髓损伤功能再生。Nicolas 等19可知 Notch 信号在一定条件下具有抑制 Wnt 信号传导的
25、作用，因此猜测在 Wnt1 及 Wnt3a 蛋白检测中，脊髓损伤大鼠在经过烙灸治疗后其蛋白表达量远低于模型组及甲基强的松龙组，恰恰是 Notch 通路对 Wnt1 及Wnt3a 的抑制作用。因此 Wnt、Notch 信号通路相互影响20，在脊髓损伤发生后在进行烙灸后，Wnt、Notch 信号通路间的作用及对通路相关因子的作用仍待进一步研究。综上，通过检测脊髓损伤后 Wnt、Notch 信号通路相关因子的蛋白表达量的变化，发现烙灸可以通过调节 Wnt、Notch 信号通路，来实现脊髓损伤后对神经功能的重建，达到修复受损神经干细胞作用，且该疗法相较于其他治疗费用低，操作简单，便于临床推广。参考文献
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