1、1“分子手术刀”限制性核酸内切酶(限制酶)(1)存在：主要存在于原核生物中。(2)特性：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。(3)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论 是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到 一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。如 以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGGGGTCC以AT为轴，两侧 碱基互补对称。(4)切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端(如图所示)。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，
2、而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。2“分子缝合针”DNA连接酶 种类EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能特性只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低相同点都缝合磷酸二酯键，如图3“分子运输车”载体(1)载体具备的条件 能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环 状DNA分子。(3)其他载体：噬菌体的衍生物、动植物
3、病毒。特别提醒 获取目的基因和切割载体时使用同一种限制酶，目的是 产生相同的黏性末端。获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末 端或平末端。限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以 便于检测。1限制酶可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下 图为四种限制酶BamH、EcoR、Hind及Bgl的辨识序列及每一种限制酶的特定切割部位。其中哪两种限制酶切割出来的DNA片段末端可以互补结合，其末端互补序列是 ()ABamH和EcoR；末端互补序列：AATT BBamH和Hind；末端互补序列：GATC CBamH和Bgl；末端互补序列：GATC DEcoR和Hind；末端互补序列
4、：AATT 解析：BamH和Bgl切出的黏性末端碱基能互补配对，互补序列都含有GATC。答案：C 1目的基因的获取(1)从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因组文库 或cDNA文库中获取。(2)人工合成目的基因：根据已知的核苷酸序列利用原料以 化学方法合成。常用的方法有反转录法和化学合成法。(3)利用PCR技术扩增目的基因 通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大 量的目的基因。2基因表达载体的构建(基因工程的核心)(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可遗传给下 一代，并能够表达和发挥作用。(2)基因表达 载体组成 目的基因启动子：为RNA聚合酶识别和结合部位，驱动转
5、录mRNA终止子：使转录终止的特殊结构的DNA片段标记基因：为鉴定受体细胞是否含有目的基因 (3)过程 3将目的基因导入受体细胞(1)导入原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。(2)导入过程 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法(主要)、基因枪法和花粉管通道法 显微注射技术 Ca2处理法 生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感
6、受态细胞吸收DNA分子4目的基因的检测与鉴定(1)分子水平检测 导入检测：DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标 记的含目的基因的DNA片段作为探针检测。表达检测 转录检测：分子杂交法，即以目的基因作为 探针与mRNA杂交翻译检测：抗原抗体杂交法(2)个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接 种实验。特别提醒 只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配 对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要 求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，称为转
7、化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。2(2011沈阳调研)下图为利用生物技术获得生物新品 种的过程示意图。据图回答：(1)随着科技发展，获取目的基因的方法也越来越多，若乙图中的“抗虫基因”是利用甲图中的方法获取的，该方法称为_。图中过程与细胞中DNA复制过程相比，该过程不需要_酶。是在_(填“酶的名称”)作用下进行延伸的。(2)在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kanR)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。乙图为获得抗虫棉技术的流程。A过程需要的酶有_、_。图中将目的基因导入植物受体细胞采用的方法是_。C过程的培养基除含有必要营养
8、物质、琼脂和激素外，还必须加入_。(3)离体棉花叶片组织经C、D、E成功地培育出了转基因抗虫植株，此过程涉及的细胞工程技术是_，该技术的原理是_。(4)检测目的基因是否转录出mRNA的具体方法是使用_与提取出的_做分子杂交。(5)科学家将植物细胞培养到_，包上人工种皮，制成了神奇的人工种子，以便更好地大面积推广培养。解析：(1)图甲是利用目的基因作为模板的基因体外扩增过程，即利用了PCR技术扩增目的基因。图甲中过程利用高温使DNA双链解旋，因是在高温环境下合成DNA，故所需的DNA聚合酶是热稳定性较高的Taq酶。(2)图乙中A过程是获得重组质粒的过程，该过程需要用限制性内切酶对质粒、目的基因进
9、行切割，再在DNA连接酶的催化作用下形成重组质粒。因土壤农杆菌易侵染植物细胞，故一般用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。培养基中加入卡那霉素是为了筛选导入重组质粒的受体细胞。(3)利用植物组织培养技术可以将带有目的基因的植物细胞培育成 转基因植株，该技术利用了植物细胞全能性原理。(4)因mRNA碱基可以与目的基因模板链碱基互补配对，故可用标记的目的基因作探针对细胞中的mRNA进行检测，以确定目的基因是否转录。(5)将培养到分化出不定芽的胚状体包上人工种皮，可以获得人工种子。答案：(1)利用PCR技术扩增目的基因 解旋 热稳定DNA聚合酶(Taq酶)(2)限制性核酸内切酶 DNA连接酶 农
10、杆菌转化法 卡那霉素(3)植物组织培养 细胞全能性(4)标记的目的基因 mRNA分子(5)胚状体(或答“不定芽”“顶芽”“腋芽”也可)1蛋白质工程的概念：以蛋白质分子的结构规律及其生物 功能的关系作为基础，通过基因的修饰或基因的合成，对 现有的基因进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人 类生产和生活的需求。2蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产出天然蛋白质，蛋白质工程是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质。3蛋白质工程与基因工程 项目区别与联系蛋白质工程基因工程过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入
11、受体基因目的基因的检测与鉴定实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品区 别结果 可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联 系蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造3下列关于蛋白质工程的说法正确的是 ()A蛋白质工程以基因工程为基础 B蛋白质工程就是提高蛋白质产量的工程 C蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造 D蛋白质工程只能生产天然的蛋白质 解析：蛋白质工程就是根据人们对蛋白质功能的特定需求，设计出特定蛋白质并通过基因工程生产出来的生物工程，能生产出自然界本
12、来没有的蛋白质。其操作对象是基因，对基因进行改造，以生产出特定蛋白质。答案：A(1)从近几年新课标地区生物试题看，知识点分布主要集中 在以下两个方面：“基因工程的原理、技术与应用”考点无疑是本专题近几年新课标高考的最大热点，如2010全国卷T5、2010浙江卷T2、2010天津卷T7、2010江苏卷T27、2009浙江卷T3、2009年江苏卷T34、2008海南卷T26、2008江苏卷T32、2008广东卷T39都考查了基因工程的工具与操作技术和应用。命题角度 基因工程 基因工程的应用在近几年新课标高考试题中的出现频率也较高，如2009广东卷T39、2007广东卷T27和T41分别考查了动、植
13、物基因工程应用，2006广东卷T23则考查了基因诊断、基因治疗知识。(2)近几年新课标高考试题中基因工程的题目，多是与胚胎 工程、微生物的培养、克隆技术、组织培养等知识综合考查学生解决实际问题的能力，特别是理综试题。预计2012年高考这种命题趋势还会延续。(2010天津高考)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答：(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用_限制酶 同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含_的培养基上进行。(2
14、)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序 列是_(填字母代号)。A启动子 BtetR C复制原点 DampR(3)过程可采用的操作方法是_(填字母代号)。A农杆菌转化 B大肠杆菌转化 C显微注射 D细胞融合(4)过程采用的生物技术是_。(5)对早期胚胎进行切割，经过程可获得多个新个体。这 利用了细胞的_性。(6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用_(填 字母代号)技术。A核酸分子杂交 B基因序列分析 C抗原抗体杂交 DPCR 解析 本题综合考查基因工程和胚胎工程的相关知识，同时考查利用所学原理解决实际问题的能力。(1)Sam 酶切位点在人乳铁蛋白基因内，如用其酶切，则会破坏目的基因
15、，故排除。为防止目的基因和载体自身连接，在利用限制酶进行切割时，两端需要剪切成不同的黏性末端，因此需要用BamH 和Hind 两种限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。因人乳铁蛋白基因插入位置位于tetR四环素抗性基因内，因此该基因不能表达而导致受体细胞无四环素抗性；又因为载体上的ampR氨苄青霉素抗性基因未被破坏，所以受体细胞具有氨苄青霉素抗性，故筛选含有 重组载体的大肠杆菌需要在含氨苄青霉素的培养基上进行。(2)启动子位于基因的首端，可驱动基因转录出信使RNA，使基因得以表达，故属于调控序列。(3)过程将目的基因导入到动物的受精卵中，一般采用显微注射法。(4)过程表示将早期胚胎移入代孕牛体内
16、继续发育，故为胚胎移植技术。(5)早期胚胎分割成几份后，每份经移植和培养后都能形成一个新的个体，利用了细胞的全能性。(6)人乳铁蛋白基因成功表达的标志是产生了人乳铁蛋白，因此可利用抗原抗体杂交技术检测其是否成功表达。答案(1)Hind 和BamH 氨苄青霉素(2)A(3)C(4)胚胎移植技术(5)全能(6)C 1(2010全国卷)下列叙述符合基因工程概念的是()AB淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴 细胞中的抗体基因 B将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得 能产生人干扰素的菌株 C用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获 得青霉素高产菌株 D自然界中天然存在的噬
17、菌体自行感染细菌后其DNA整合 到细菌DNA上 答案：B 解析：基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术，是一种人为的操作过程。A项属于细胞工程；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项是自然发生的，不是人为操作的，不属于基因工程。2(2010浙江高考)在用基因工程技术构建抗除草剂的转 基因烟草过程中，下列操作错误的是 ()A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C将重组DNA分子导入烟草原生质体 D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞 解析：限制性核酸内切酶切割的是DNA，而烟草花叶病毒的遗传物质为RNA；目的基因与载体的连接由DNA
18、连接酶催化连接；受体细胞为植物细胞，所以可以是烟草原生质体；目的基因为抗除草剂基因，所以筛选的时候应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞。答案：A 3(2009浙江高考)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生 物活性 D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促 进目的基因的表达 解析：目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；基因工程中常用的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶；大肠杆菌为原核生物，不含有内质网和高尔基体等细胞器，不能对蛋白质进
19、行加工，其合成的胰岛素原无生物活性。运载体中的抗性基因为标记基因，其作用是有利于筛选含重组DNA的细胞，但不能促进目的基因的表达。答案：D 4(2010江苏高考)下表中列出了几种限制酶识别序列及其 切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶 BamH Hind EcoR Sma 识别序列及切割位点 GGATCC CCTAGG AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG CCCGGG GGGCCC (1)一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。(3)用
20、图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是_。(4)与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_ _。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_。(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。解析：(1)质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团均参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个Sma的切点，因此被
21、该酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。(2)由题目可知，Sma识别的DNA序列只有G和C，而G和C之间可以形成三个氢键，A和T之间可以形成二个氢键，所以Sma酶切位点越多，热稳定性就越高。(3)质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有Sma酶切位点，都可以被Sma破坏，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA。(4)只使用EcoR，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamH和Hind剪切时，质粒和目的基因两端的黏性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身连接产物。(5)质粒和目的基因连接后获得重组质粒，该过程需要连接酶作用，故混合后加入DNA连接酶。(6)质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。(7)目的基因为蔗糖转运蛋白基因，所用的受体细胞为丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，若将重组质粒导入了受体细胞，则受体细胞应能从培养基中吸收蔗糖，故应在以蔗糖为唯一碳源的培养基上进行培养。答案：(1)0、2(2)高(3)Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞(7)蔗糖为唯一含碳营养物质
