1、转基因巨型小鼠第3节 基因工程与转基因生物 是由普林斯顿大学的华裔科学家钱卓为首的一批科学家研究出来的。通过给老鼠植入一种额外基因NR2B，从而产生一种为NMDA的蛋白质。“杜奇老鼠”的记亿力比普通老鼠高出4至5倍。聪明鼠“杜奇”:聪明鼠“杜奇”诞生的意义？1993年，科学家培育出转基因抗虫棉，使我国第二个拥有抗虫棉自主知识产权的国家。转基因抗虫棉抗虫棉普通棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接 导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)转基因抗虫棉的培育程序：将重组DNA导入选育棉花细胞内从具有抗虫性状的细菌DNA分子中获取抗
2、虫基因将抗虫基因与运载体拼接成为重组DNA需要三种工具：限制酶（切割DNA）DNA连接酶(连接DNA和运载体)运载体(常为质粒)检测和鉴定抗虫基因在该棉花细胞中表达切割DNA的工具限制性核酸内切酶就是当异源DNA分子渗入细胞后，要遭到它的切割破坏专一性能识别双链DNA分子的某些特定脱氧核苷酸序列，并且切断其中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的键。例如：特点：限制酶EcoR识别的碱基序列G A A T T CC T T A A G限制酶Hind识别的碱基序列A A G C T TT T C G A A限制异源DNA的入侵并使之失去活力，对自身的DNA无损害作用。限制酶切割时产生黏性末端，DNA双链不
3、在同一处断开，产生的片段带有数个碱基尾巴。G A A T T C G A A T T CC T T A A G C T T A A GA A T T C G G C T T A A 黏性末端黏性末端切下的DNA片段DNA连接酶广泛存在于：细菌、噬菌体、酵母菌、植物和动物细胞内。作用：将断裂的DNA黏性末端连接起来基因工程的运载体质粒概念：独立于细菌拟核DNA外的，能自主复制的双链闭环的DNA分子。质粒DNA分子含有特殊遗传标记基因，如：抗四环素抗性基因抗青霉素抗性基因基因工程基因工程是指依据预先设计的蓝图，用人工方法将某种生物的基因，接合到另一种生物的基因组DNA中并使其表达，是后者获得新的遗
4、传性状，产生出人类所需要的产物，或创造出新的生物类型的现代生物技术。在宿主细胞内可以独立复制，也可以接合到宿主细胞的DNA分子中二、基因工程的基本步骤1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建（目的基因与运载体重组）3、重组DNA分子导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定（筛选含目的基因的受体细胞）目前广泛提取使用的目的基因有：抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。一、目的基因的获取 限制酶 可从自然界已有的物种分离，也可用人工方法获取。供体生物细胞 取出DNA 用限制酶剪去多余部分 目的基因 获取目的基因目的基因是人们为了得到其表达产物而把它转入到新的生物体
5、中去的基因1、目的基因主要指_ 编码蛋白质的结构基因 2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）化学方法人工合成 未知序列已知序列(一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 1.基因文库概念 2.基因文库类型 基因组文库 部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因）（cDNA文库）（未知序列）基因组文库与部分基因文库的关系基因组文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存基因4.cDNA文库的构建 提取某种生物的某器官或特定发育时期的m
6、RNA 单链DNA 双链cDNA片段 重组载体 与载体 连接 cDNA文库 反（逆）转录酶 DNA 聚合酶 导入受体菌 中储存 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA（反转录法）以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。思考为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有这种生物的部分基因？1、某个时期的发育是基因选择性表达的结果2、mRNA 不含原DNA中内含子，反转录所得DNA无内含子基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 1、概念：PCR全称
7、为_，是一项在生 物_复制_的核酸合成技术 3、条件：2、原理：_ 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制(二)利用PCR技术扩增目的基因 模板（目的基因）原料(脱氧核苷酸)引物（一小段单链DNA）热稳定DNA聚合酶（耐高温）温度控制 4、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。（已知序列）PCR技术PCR扩增仪 以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）指数 2n 5、扩增形式在短时间内大量扩增目的基因6、扩增结果7、过程：a、变性（90-95）：双链DNA模板在热作 用下，_断裂，形成_ b、复性（55-60）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部_。c、延
8、伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物开始进行碱基互补配对，合成与 模板互补的_。氢键 单链DNA双链 DNA链 n 过程 变性、退火、延伸三步曲 变性退火延伸利用PCR技术扩增目的基因动画演示1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为循环次数)（24-1）2=30PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术 DNA复制 相同点 原理 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成
9、整个DNA分子（三）人工合成法 DNA合成仪推测推测合成1、前提：基因比较小、核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸顺序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因（序列已知）2、方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因3、过程：1、若未知目的基因的核苷酸序列，可采用_总结：获取目的基因的三种方法应用1、若知道目的基因两端的核苷酸序列，且基因比较大，可采用_2、若已知目的基因序列，且基因比较小，可采用_PCR技术扩增化学方法人工合成从基因文库获取的方法方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）优点操作简单专一性可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生
10、自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较麻烦、技术要求过高需要严格控制温度，技术要求高适用范围小提取目的基因的方法与比较二：基因表达载体的构建基因工程的核心 1 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2 组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等 2.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞载体与表达载体的区别：均有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体比载体增加了目的基因、启动子、终
11、止子三部分结构。注意!用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。3.基因表达载体的构建过程 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口 四个黏性末端 DNA连接酶 基因表达载体（重组DNA分子或重组质粒）同一种 一个切口 两个黏性末端 三、将目的基因导入受体细胞 1 转化：（1）概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）实质：基因重组。2 常用的受体细胞：细菌：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌；酵母菌（
12、真核生物）：生产糖蛋白（干扰素）时作受体细胞；植物细胞：体细胞、卵细胞、受精卵 动物细胞：常用受精卵（全能性高）。3 目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法基因枪法花粉通道法 显微注射法 Ca2处理法 受体细胞 一般为体细胞 受精卵 一般原核细胞 4、目的基因导入受体细胞的方法 1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转
13、入 农杆菌（受体细胞：体细胞）（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。单子叶植物中较常用适用于单子叶植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物常用受体细胞：受精卵3 将目的基因导入微生物细胞 微生物作受体
14、细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 常用菌：大肠杆菌 常用法：Ca2+处理（获得感受态细胞）（增大细菌细胞壁的通透性）过程：Ca2+处理 大肠杆菌 感受态细胞感受态细胞 吸收DNA表达载体与感受态细胞混合从细胞器的功能分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，能否用大肠杆菌？【提示】不能，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌为原核生物，不含有这两种细胞器。问题(四)目的基因的检测与鉴定 检测 导入检测：目的基因是否导入受体细胞 方法 DNA分子杂交 表达检测 转录检测分子杂交 翻译检测抗原-抗体杂交 分子检测法 鉴定 抗虫鉴定 抗病鉴定
15、活性鉴定等 个体水平的鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？成功导入概率极小，实际能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测和筛选问题问题1）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D2、下列有关基因工程技术的正确叙述是-（）细菌质粒是基因工程常用的运载体所有的限制酶都能识别同一种特定的核苷酸序列选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快只要目的基因进入了受体细胞就能成功地实现表达A.B.C.D.C
16、3、与“限制性内切酶”作用部位完全相同的酶是-（）A反转录酶BRNA聚合酶CDNA连接酶D解旋酶4限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对GAATTC专一识别的限制酶，打断的化学键是-（）AG与A之间的键BG与C之间的键CA与T之间的键D磷酸与脱氧核糖之间的键CD三、基因工程的类型按转入的外源基因所在的表达系统 分为：微生物基因工程植物基因工程动物基因工程特点：操作较容易，研制周期较短，通过发酵大量生产成果：药用蛋白质的规模化生产结构简单繁殖迅速例如：胰岛素依赖性糖尿病人胰岛素肢端肥大症 人生长激素释放抑制因子肺气肿 抗胰蛋白酶恶性肿瘤 白细胞介素溶血栓 组织型纤溶酶原吉
17、活剂抗肿瘤 肿瘤坏死因子微生物基因工程微生物基因工程生产胰岛素我国生产的部分基因 工程疫苗和药物 胰岛素、生长激素、干扰素、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，为提高人类的健康水平发挥了重大作用。基因工程得到的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解多种毒害物质。植物基因工程成果：培育出抗性植物，如：我国的转基因抗虫棉。全世界有近200种转基因植物，我国有抗病毒烟草、耐储存转基因番茄。正在研究将预防乙型肝炎、龋齿等疾病的疫苗基因转入植物，培
18、育植物疫苗，以期通过食物获得疫苗接种。转鱼抗寒基因的番茄 不会引起过敏的转基因大豆 动物基因工程特点：以受精卵作为受体细胞用显微注射的方法将目的基因导入受精卵使受精卵发育成转基因动物成果：巨型小鼠（内含外源生长激素基因）（1）生产人源性蛋白质药物-乳腺生物反应器：将所需要基因转入乳量高的牛、羊等家畜体内，从动物的乳汁中获得人源性蛋白质药物。乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)可以培育生产人源性蛋白质药物的动物（即动物基因工程培育的乳腺生物反应器）转基因山羊1998年初，上海医学遗传研究所报道：中国科学家已经获得5只转基因山羊。其中一只母山羊的乳汁中，含有治疗血友病的药物蛋白有活性的人凝血因
19、子。（2）获取具有优良性状的动物新品种耐不良环境的转基因鱼 1.以下说法正确的是 （）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来 C2.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C31987年，美国科学家将萤火虫的萤光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达。长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇
20、迹。这一研究成果表明 （）萤火虫与烟草植物的DNA结构基本相同 萤火虫与烟草植物共用一套遗传密码 烟草植物体内合成了萤光素 基因能够控制蛋白质的合成 A B C D B4.上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转基因牛，转基因动物是指（）A提供基因的动物 B基因组中增加外源基因的动物 C能产生白蛋白的动物 D能表达基因信息的动物 B五、转基因生物产品的安全性转基因生物是否会对生态系统产生不利的影响？转基因食品是否会对人类健康造成损害（如致敏）？转基因食品 安全吗?!转基因安全事件 英国“普兹台事件”：1998年，英国罗伊特研究所普兹台教授说他的实验证明，幼鼠食用转基因土豆会使内脏和免疫
21、系统受损。转基因安全事件 美国的“斑蝶事件”：1999年美国康乃尔大学副教授约翰罗西在自然上发表文章说，一种转基因玉米可产生杀死害虫的花粉，而身为益虫的一种美州大蝴蝶食用了这种转基因玉米花粉后有44死亡。科学家赋予了转基因植物某些全新的性状，增强了它们与其他生物的生存竞争能力，可能会成为某一地区新的优势种，并使新的基因大量扩散。A、不能排除转基因生物对生态系统可能造成的负面影响 转基因生物环境安全性 抗除草剂基因等可能会通过花粉传播或近缘杂交进入到杂草或半驯化植物中，结果产生出超级杂草。B、转基因植物演变成农田杂草的可能性 转基因产品环境安全性 C、诱发病虫产生抗性 具有抗虫功能的转基因植物，其体内产生的抗虫蛋白可能使害虫产生抗性，使害虫变得更加难以防治。转基因产品环境安全性 转基因食品的安全性转基因食品可能会给人类身体健康带来某些损害。（1）有毒物质抗性选择标记基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质，或者编码出的蛋白质所具有的催化功能对宿主的代谢具有潜在毒性作用，并出现滞后效应或长期效应。（2）过敏性转基因植物可能会表达出过敏蛋白，可能会对过敏体质的人产生过敏反应。双刃剑辩证的看待知情权知悉和了解选择权科学的选择如何对待转基因生物产品？课究探后课题：利用网络资源并结合教材中的“阅读与思考”,就“转基因生物和转基因食品的安全性”以小论文的形式发表个人见解。
