1、11 DNA重组技术的基本工具学 习 目 标知 识 体 系1.了解基因工程的概念、诞生及发展。2.掌握限制酶及DNA连接酶的作用。(重点、难点)3.理解载体需具备的条件。(重点)01 探新知 自主梳理02 破重难 讲练互动03 固双基 当堂达标04 课后 巩固提升一、基因工程概述1基因工程的概念2基因工程的诞生和发展(1)基础理论的重大突破是遗传物质的证明；DNA双螺旋结构和的确立；的破译。DNA中心法则遗传密码(2)技术发明使基因工程的实施成为可能基因转移载体和相继发现；技术的发明；DNA体外重组得到实现及获得成功。(3)基因工程的发展与完善1983年，世界第一例培养成功，基因工程进入迅速发
2、展阶段。1988年的发明，使基因工程进一步发展和完善。工具酶DNA合成和测序重组DNA表达实验转基因烟草PCR技术二、基因工程的基本工具1限制性核酸内切酶(也称“限制酶”)“分子手术刀”(1)来源：主要来自。(2)种类：分离出了约种。(3)特点：具有专一性。识别双链DNA分子的某种。切割中的特定位点。(4)作用：断开两个核苷酸之间的。(5)结果：产生或。原核生物4000特定核苷酸序列特定核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平末端2DNA连接酶“分子缝合针”(1)种类种类比较项目Ecoli DNA 连接酶T4 DNA连接酶来源特点只能“缝合”具有的双链DNA片段既可以“缝合”双链DNA片段互补的，又可以
3、“缝合”双链DNA片段的大肠杆菌T4噬菌体互补黏性末端黏性末端平末端(2)作用结果：恢复被切开的两个核苷酸之间的，拼接成新的DNA分子。限制酶磷酸二酯键3基因进入受体细胞的载体“分子运输车”(1)种类：通常用作为载体，另外还有噬菌体的衍生物和等。(2)作用将目的基因到受体细胞中去。在受体细胞内对目的基因进行大量。(3)必备条件在宿主细胞中能保存下来并大量。有一个至多个。有特殊的，便于筛选。对无害。质粒动植物病毒转运复制复制限制酶切割位点标记基因受体细胞三、重组DNA分子的模拟操作1材料用具：剪刀代表，透明胶条代表连接酶。2切割位点(1)分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出GAATTC序列，并
4、选GA之间作切口进行“切割”。(2)再从另一条链上之间寻找EcoR相应的切口剪开。3操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能；否则，说明操作有误。EcoRDNA互补的碱基互补配对预习小测1想一想一个质粒是否只能插入一种目的基因？提示：不是，质粒上有多个限制酶的切割位点，所以可以插入多种基因。2判一判(1)基因工程的原理是基因重组，不过这种变异是定向的。()(2)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。()(3)DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。()(4)限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。()(5)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(
5、)(6)载体的种类有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。()(7)DNA连接酶能连接所有相同或互补的黏性末端，故该酶没有专一性。()探究主体 1 基因工程的工具酶问题情境 1.下图中的图 1 和图 2 分别表示的是 EcoR限制酶和 Sma限制酶的作用示意图。请据图回答：(1)请说出EcoR限制酶和Sma限制酶识别的碱基序列及切割的位点。提示：EcoR限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；Sma限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。(2)EcoR限制酶和Sma限制酶作用的结果分别是什么？提示：EcoR限制酶将DNA切割成黏
6、性末端，Sma限制酶将DNA切割成平末端。(3)以上实例说明限制酶有何特性？该特性的含义是什么？提示：说明限制酶具有专一性。专一性指的是限制酶能识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上进行切割。2DNA连接酶、限制酶和DNA聚合酶都作用于哪种化学键，分别对这种化学键有何影响？提示：均作用于磷酸二酯键，DNA连接酶和DNA聚合酶是形成磷酸二酯键，限制酶是破坏磷酸二酯键。1限制酶与DNA连接酶的比较(1)区别项目作用应用限制酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于基因表达载体的构建(2)两者的关系可表示为：(3)磷酸二酯键指的是下图圆圈
7、中的化学键，而限制酶切割或DNA连接酶连接的只能是箭头所指处的化学键，因为圈中另一个化学键属于一个核苷酸的内部结构。2DNA连接酶与DNA聚合酶的比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点模板不需要模板需要DNA的一条链为模板作用对象游离的DNA片段单个的脱氧核苷酸作用结果形成完整的DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程DNA复制易错警示(1)限制酶不切割自身DNA的原因是该生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。(2)限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。(3)DNA连接酶无识别的特异性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。1下表为常用的限
8、制性核酸内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，以下说法中，推断正确的是()注：Y表示C或T，R表示A或G。A一种限制酶只能识别一种核苷酸序列B限制酶切割后一定形成黏性末端C不同的限制酶可以形成相同的黏性末端D限制酶的切割位点在识别序列内部解析：根据表格内容可以推知，每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列，但不一定是一种序列，如限制酶Hind，A项错误；限制酶切割后能形成黏性末端或平末端，B项错误；不同的限制酶切割后可能形成相同的黏性末端，如限制酶BamH和Sua3A切割后露出的黏性末端相同，C项正确；限制酶的切割位点可以位于识别序列的外侧，如Sau3A，D项错误。答案：C2下列关于DNA连接酶作
9、用的叙述，正确的是()A将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键B将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键C连接2条DNA链上碱基之间的氢键D只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接解析：DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。答案：B提示：小型环状DNA。2所有载体都是质粒吗？为什么？提示：不是，除了质粒外，载体还有动植
10、物病毒和噬菌体的衍生物。探究主体 2 基因工程中的载体问题情境 1.质粒作为目的基因的载体，其本质是什么？3将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？提示：不可行，因为如果没有载体导入受体细胞，目的基因无法进行自我复制和稳定存在以及表达。4质粒上的一些抗生素抗性基因有什么作用？提示：检测目的基因是否导入受体细胞。1作为载体所具备的条件条件分析稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择无毒害作用避免受体细胞受到损伤2.常用载体的种类及用途种类用途质粒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞噬菌体的衍生物植物病毒将
11、外源基因导入植物细胞动物病毒将外源基因导入动物细胞3.基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别基因工程中的载体细胞膜上的载体蛋白本质细菌的质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等细胞膜上的蛋白质作用携带外源基因进入受体细胞中，并在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制运载要进出细胞的特定物质1质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是()A质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子B在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制D质粒上的抗性基因
12、常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择解析：质粒不只分布于原核生物中，在真核生物酵母菌细胞内也有分布，A项错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C项错误；质粒上抗性基因常作为标记基因，D项正确。答案：D2某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆
13、菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作
14、为载体，其DNA复制所需的原料来自_。解析：(1)质粒被选用为基因工程的载体是因为：具有一个或多个限制酶切点；具有自我复制能力；带有标记基因；对受体细胞无害。(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上，四环素抗性基因被破坏，在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上，不能生长的为要筛选的菌落，即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体营寄生生活，能利用宿主细胞内的原料和场所进行自
15、身DNA的复制和蛋白质的合成。答案：(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素(3)受体细胞夯实生命观念1基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA分子重组技术。2限制酶主要从原核生物中分离提纯出来，能够识别DNA分子中特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。3DNA分子经过限制酶切割后形成黏性末端或平末端。4DNA连接酶可将两个DNA链连接起来，主要有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶。5目的
16、基因的主要载体是质粒，它是一种能够自我复制的小型环状DNA分子。注重思维表达1限制性核酸内切酶的作用特点体现了酶的哪种特性？提示：限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列，并且只能在特定部位切割，这说明了酶具有专一性。2不同限制酶切割形成的黏性末端能发生黏合吗？借助于什么方式来完成黏合？提示：能。前提是不同限制酶切割形成的黏性末端要互补，通过碱基相互配对形成氢键的方式来完成黏合。3霍乱弧菌中也含有质粒，能否用来作为载体？为什么？提示：不能。因为我们选择的载体应该对受体细胞无害。1科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术基因工程。实施该工程的最终目的是()A定向提取生物体的DNA分子B定向
17、地对DNA分子进行人工“剪切”C在生物体外对DNA分子进行改造D定向地改造生物的遗传性状解析：基因工程的内容就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物，也就是定向地改造了生物的遗传性状。答案：D2下列关于限制酶的说法，不正确的是()A限制酶广泛存在于各种生物中，主要分布在真核生物中B限制酶可以将DNA分子切开C一种限制酶通常只能识别一种特定的核苷酸序列D一般不同的限制酶切割DNA的切点不同解析：限制酶主要是从原核生物中分离出来的，并不是广泛存在于各种生物中；DN
18、A分子可被限制酶特异性切割；一种限制酶通常只能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。答案：A3能够将具有平末端的DNA片段连接起来的酶是()AEcoli DNA连接酶 BRNA聚合酶CT4DNA连接酶DDNA聚合酶解析：T4DNA连接酶既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端，但连接平末端之间的效率比较低。Ecoli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。答案：C4质粒之所以能作基因工程的载体，是由于它()A含蛋白质，能完成生命活动B能够自我复制，保持连续性C是RNA，能够指导蛋白质的合成D具有环状结构，能够携带目的
19、基因解析：质粒是小型环状DNA分子，能够自我复制，且对受体细胞无毒害，故可用作基因工程的载体。原核生物的拟核DNA也呈环状，但不能作基因工程的载体。答案：B5如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。(1)a 代表的物质和质粒的化学本质相同，都是_，二者还具有其他共同点，如_。(写出两条即可)(2)若质粒 DNA 分子的切割末端为 ATGCGC，则与之连接的目的基因切割末端应为_；可使用_把质粒和目的基因连接在一起。(3)氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因 在 质 粒 DNA 上 称 为 _，其 作 用 是_。(4)下列常在基因工程中用作载体的是()A苏云金芽孢杆菌抗虫基因B土壤农杆菌环状RNA分子C大肠杆菌的质粒D动物细胞的染色体解析：质粒是基因工程中最常用的载体，是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点，进入受体细胞后能自我复制，具有标记基因便于重组DNA的鉴定与选择。答案：(1)DNA 能够自我复制、具有遗传效应(2)CGCGT A DNA 连接酶(3)标记基因 供重组 DNA 的鉴定和选择(4)C04 课后 巩固提升
