1、课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段学 习 目 标知 识 体 系1.简述PCR的原理。(重点、难点)2.尝试PCR技术操作。(重点)3.讨论PCR的应用。01 探新知 自主梳理02 破重难 讲练互动03 固双基 当堂达标04 课后 巩固提升一、PCR原理与条件1PCR的概念：PCR即，是一种体外迅速扩增的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。多聚酶链式反应DNA片段2细胞内DNA复制的基本条件参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的4种合成子链的原料催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的端开始连接脱氧核苷酸解旋酶模板脱氧
2、核苷酸DNA聚合酶3 3.PCR原理(1)DNA变性：在的温度范围内，DNA的将解体，双链分开。(2)DNA复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的又会重新结合成双链。(3)子链的合成：DNA聚合酶从引物的开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的向延伸。4PCR条件(1)原料：。(2)模板：加热变性解旋后的两条DNA母链。(3)酶：耐热的。(4)引物：使DNA聚合酶能够从引物的开始连接脱氧核苷酸。(5)其他条件：需要稳定的缓冲溶液和能自动调节温度的温控设备等。80100 双螺旋结构DNA链3端5端3端4种脱氧核苷酸DNA聚合酶3端二、PCR过程与结果1PCR过程过程温度主要变化变性 以上双
3、链DNA解聚为复性 左右通过碱基互补配对分别与两条结合延伸 左右溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，G，C)在的作用下，根据原则合成新的DNA链90单链50单链DNA两种引物72DNA聚合酶碱基互补配对2.PCR的结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于的DNA序列，使这段固定长度的序列呈扩增。两个引物之间指数三、PCR实验操作1实验用具名称作用PCR仪自动调控，实现DNA的扩增微量离心管实际上是进行PCR反应的微量移液器用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后，其上的枪头都必须温度场所更换2.实验步骤准备：按照 PCR 反应需要的物质和条件，将需要的试剂和仪器准备好 移液：用按照配
4、方在微量离心管中依次加入各试剂 混合：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻弹，使反应液混合均匀 离心：将微量离心管放在离心机上，离心约 10 s，使反应液集中在 反应：将离心管放入中进行反应微量移液器管的侧壁离心管底部PCR仪3DNA含量的测定(1)测定原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与有关。(2)计算方法：DNA含量(g/mL)稀释倍数。DNA含量50(260nm的读数)预习小测1连一连2判一判(1)生物体内DNA复制需要解旋酶、DNA母链、4种脱氧核苷酸、DNA聚合酶和引物等条件()(2)在一条脱氧核苷酸链中，含有羟基的末端为5端，含有磷酸基团的末端为3端()
5、(3)DNA合成子链的方向总是从子链的5端向3端延伸()(4)PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合()(5)PCR一般要经过多次循环，每次循环都要经历复性、变性和延伸三个阶段()(6)PCR呈指数扩增DNA片段，是因为上一轮反应产物可作为下一轮反应模板()探究主体 1 PCR 原理与反应过程问题情境 下面是 PCR 过程图示，据图讨论：(1)PCR是一项在生物体外复制特定的完整DNA分子的核酸合成技术吗？提示：不是，PCR是一项在生物体外复制特定的DNA分子片段的技术。(2)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一
6、小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链。(3)PCR技术中需要的两种引物碱基序列相同吗？为什么？提示：不同。由于DNA两条模板链中碱基序列并不相同，引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此DNA两条模板链在进行扩增时，需要的引物碱基序列是不同的。(4)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。提示：每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。细胞内DNA复制与PCR扩增的比较项目细胞内DNA复制PCR扩增不同点时间有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期人工控制随时进行场所
7、细胞内细胞外(PCR 仪)能量ATP提供能量不需ATP提供能量解旋解旋酶高温变性合成酶DNA聚合酶等耐热的Taq DNA聚合酶项目细胞内DNA复制PCR扩增不同点特点边解旋边复制全解旋复制循环次数受生物体自身控制30多次pH细胞自我调控缓冲液温度环境影响或体温调节PCR仪或不同温度的水浴锅相同点原料四种脱氧核苷酸原则严格遵循碱基互补配对原则模板DNA为模板方式半保留复制引物都需要与模板相结合的引物易错警示与PCR原理有关的三个易错点(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。(2)D
8、NA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。1PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A BCD解析：
9、PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为2030个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。答案：C2下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是()A片段a、b、c的长度均相同B片段a、b只是第一次循环的产物C片段c最早出现在第二次循环的产物中D经过30次循环后，片段c的数量为230解析：图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b
10、，B项不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C项正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，故D项不正确。答案：C方法技巧PCR产物的分析(1)PCR产物的种类：主要看其DNA片段上的引物种类。若只有一种引物，则是原始模板复制的产物，在每次循环中均有。若含有两种引物，则最早出现在第二次循环，以后每次循环中均有。(2)PCR产物的数量(以1个DNA分子经n次循环扩增的产物分析)。PCR产物的总数量：2n。PCR扩增的特异性片段的数量：2n2。探究主体 2 PCR 技术的实验操作问题情境 1.实验操作步骤提示：移
11、液器 移液器 混合均匀 离心管底部2DNA 含量的测定方法_：取 2 L PCR 反应液，加入 98 L 蒸馏水，将样品进行 50 倍稀释 _：以蒸馏水作为空白对照，在波长 260 nm 处，将紫外分光光度计的读数调节至零 _：取 DNA 稀释液 100 L 至比色杯中，测定 260 nm 处的光吸收值 _：DNA 含量(g/mL)50(260 nm 的读数)稀释倍数提示：稀释 对照调零 测定 计算1PCR过程用到的重要仪器及其作用PCR仪能够自动调控温度来控制DNA双链解聚和结合的仪器，是PCR过程的核心仪器微量移液器 用来按照配方向微量离心管分别精确加入PCR所需要的缓冲液、模板、引物、原
12、料、酶等反应成分的仪器微量离心管 实际上PCR反应进行的场所离心机可将离心管中的溶液经离心后集中在离心管底部，便于在PCR仪中进行反应紫外分光光度计可对PCR的反应结果的样品进行DNA含量的测定(DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰)2.PCR过程的两点提醒(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第二次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。3PCR产物的分析(1)若只有一种引物，则
13、是原始模板复制的产物，在每次循环中均有。(2)若含有两种引物，则最早出现在第二次循环，以后每次循环中均有。1使用PCR仪的具体实验操作顺序应为()设计好PCR仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部A BCD解析：PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。答案：C2下列有关DNA含量测定的叙述，错误的是()A可利用DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰这一特点来进行DNA含量的测定B测定时通常需要对样品
14、进行稀释C直接将样品放在波长260 nm处，测定其光吸收值D可利用“DNA含量50光吸收值稀释倍数”来计算样品中的DNA含量解析：对样品进行测定前要以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零，而不能直接测定样品的光吸收值。答案：C夯实生命观念1DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链。2DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。3PCR反应需要DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。4PCR原理：DNA热变性原理。5PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。6PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。注重语言表达1细胞
15、内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？提示：需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。2PCR引物应根据什么进行设计？提示：根据需要扩增的目标DNA碱基序列进行设计。3DNA中的氢键打开需要解旋酶或者高温，那么氢键合成时是否需要酶的催化？提示：不需要。当一个游离的脱氧核苷酸中的碱基能与DNA模板上的碱基互补配对时，两个脱氧核苷酸相互靠近，其中的碱基就能合成氢键，不需要酶的催化。1多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。下列有关PCR过程的叙述，不正确的是()A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键B复性过程中引物与
16、DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的C延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D与细胞内DNA复制相比，PCR反应体系中酶的最适温度较高解析：变性是为了使DNA内部的氢键断裂，打开双螺旋，A正确；在复性过程中，根据碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合，B正确；延伸是形成新的DNA分子，需要以4种脱氧核苷酸为原料，且体外PCR过程中不需要提供ATP，C错误；PCR过程需要特定的耐高温的DNA聚合酶，其最适温度比细胞内DNA聚合酶的高，D正确。答案：C2PCR过程中，引物的作用是()A打开DNA双链，使DNA解旋为单链B催化合成DNA子链C使DNA聚合酶能够从引物
17、的3端开始复制D为DNA复制过程提供模板解析：DNA聚合酶无法从头开始合成脱氧核苷酸链，只能从3端开始延伸DNA链。引物是一小段DNA或RNA，使DNA聚合酶能够从引物的3端开始延伸DNA链。答案：C3PCR利用了DNA的热变性原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器。下列对PCR过程中“温度的控制”的说法，错误的是()APCR反应需要高温，这是为了确保模板是单链B延伸的温度必须高于复性温度，而低于变性温度C要用耐高温的DNA聚合酶D需要耐高温的解旋酶解析：PCR是体外DNA扩增技术，DNA双链的解开不需要解旋酶，高温可使其变性解聚。延伸是在耐高温的Taq DNA聚合酶的作用下根据碱基
18、互补配对原则合成新的DNA，延伸的温度要高于复性温度但低于变性温度。答案：D4下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是()APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，放在高温环境中迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换解析：为了避免外源DNA等因素的影响，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌，A正确；PCR所用的缓冲液和酶一般需要分装成小份，并在20 储存，B正确；PCR所用的缓冲液和
19、酶从冰箱拿出之后，放在冰块上缓慢融化，C错误；为避免液体的交叉污染，在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，D正确。答案：C5近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链间的_键完全打开，称为_；而在细胞中是在_酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入_种特定的引物。当温度降低至55 时，引物与两条“
20、舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的_端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是_。(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个，即液体环境、适宜的_和_，前者由_自动调控，后者则靠_来维持。(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制4次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是_。解析：(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性、复性、延伸，其
21、特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5端向3端。(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制4次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。答案：(1)氢 变性 解旋(2)两 3 从子链的5端向3端(3)温度 酸碱度 PCR仪 缓冲液(4)1/804 课后 巩固提升
