1、 高二生物导学案第三章 第2节DNA片段的扩增及电泳鉴定导学案3班级 姓名 【学习目标】1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。【预习案】一、实验原理1DNA片段的扩增PCR利用了 原理，通过 来控制DNA双链的 。2琼脂糖凝胶电泳(1)带电粒子：DNA分子具有 ，在一定的pH下，这些基团可以带上 。(2)迁移动力与方向：在 的作用下，带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。(3)迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 有关。(4)检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为 下被检测出来。二、方法步骤1移液：用 按
2、照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入 。2 ：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。3离心：将微量离心管放在离心机上，离心约 ，使反应液集中在管的 。4反应：将装有反应液的微量离心管放入 中，设置程序进行反应。5根据待分离的DNA片段的大小，用 配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为 的琼脂糖溶液，并加入 混匀。6将扩增得到的PCR产物与 (内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。7接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 。待指示剂前沿迁移接近 时，停止电泳。8电泳结束后，取出凝胶置于 下观察和照相。三、操作提示1为避免外源DNA等因素
3、的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。2缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在 融化。3在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的 。4在进行操作时，一定要戴好一次性手套。【探讨案】探讨点1.未出现扩增条带的主要原因有哪些？探讨点2.出现非特异性扩增条带的主要原因有哪些？探讨点3. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？探讨点4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。【检测案】（ ）1.下列关于电泳的说法，错误的是A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
4、B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动CDNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度有关D用琼脂糖凝胶电泳，DNA的电泳迁移速率完全取决于分子的大小（ ）2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是APCR产物的分子大小在250500 bp之间B3号样品为不含目的基因的载体DNAC9号样品对应植株不是所需的转基因植株D10号确定反应体系等对结果没有干扰（ ）3.下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸
5、馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在20 储存C将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化D在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换（ ）4.下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述，错误的是APCR过程需要TaqDNA聚合酶BPCR过程通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合CPCR扩增区域由两种引物来决定D电泳时，DNA的迁移速率与凝胶的浓度有关，与DNA分子的大小无关（ ）5.(2021北京海淀区模拟)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行琼脂糖
6、凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是A该载体最可能为环状DNA分子B两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C限制酶R1与R2的酶切位点最短相距约200 bpD限制酶切割时会导致作用位点的氢键和肽键断裂（ ）6.下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定步骤的说法，错误的是APCR过程中，需要加入两种引物B所有组分加入微量离心管后，需要放入离心机离心约10 sC将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜D电泳出现位置不等的几条条带，说明鉴定的PCR产物比较纯净（ ）7.用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，两种引物及其与模板链的结合位置如图所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分
7、子，下列叙述错误的是A第一轮复制得到2个DNA分子，即各一个B第二轮复制得到4个DNA分子，即各一个C第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个X基因D第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因（ ）8.(2021江苏南通模拟)PCR扩增时需考虑高质量的基因组DNA模板以及反应体系中各种组分的优化组合，下列相关叙述错误的是 A反应体系中模板DNA的量和纯度影响PCR的成功与否B设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和GC含量CTaqDNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物的增多D目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置（ ）9.下列关于DNA片段的扩增及电
8、泳鉴定原理的叙述,正确的是A.在一定的pH条件下DNA分子可带上正电荷或负电荷B.带电 DNA分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动C.DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、构象等有关,与凝胶等无关D.凝胶中的 DNA分子直接可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测 10.新型冠状病毒是一种单链RNA病毒,外面包裹着衣壳蛋白和囊膜,囊膜上存在刺突蛋白,能特异性识别细胞膜上的ACE2受体从而感染细胞。常用“荧光RT-PCR技术”进行检测,方法是取检测者的mRNA逆转录出cDNA,并大量扩增,同时用荧光标记的新型冠状病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有新型冠状病毒的cDNA。
9、请回答下列问题:探究:(1)上述“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都含有哪些物质? (2)由于核酸检测比较费时费力,现已开发出多款针对新型冠状病毒的抗原或抗体检测试剂盒,可在更短时间内得出检测结果。假如你是一名科研人员,现提供新型冠状病毒刺突蛋白基因、能产生专一针对新型冠状病毒抗体的B细胞及其他相关的生物学材料,请运用现代生物技术,设计一款能够快速大规模生产、针对新型冠状病毒抗原或抗体检测的试剂盒,简要写出生产试剂盒的设计思路(只写出针对抗原或抗体检测的一种方案即可)。第三章第2节DNA片段的扩增及电泳鉴定导学案3解析一、实验原理1DNA片段的扩增PCR利用了DNA的热变性原理，通过调
10、节温度来控制DNA双链的解聚与结合。2琼脂糖凝胶电泳(1)带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。(2)迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。(3)迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。(4)检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。二、方法步骤1移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。2混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。3离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10
11、 s，使反应液集中在管的底部。4反应：将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。5根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。6将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。7接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。8电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。三、操作提示1为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须
12、进行高压灭菌处理。2缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4在进行操作时，一定要戴好一次性手套。【探讨案】探讨点1.未出现扩增条带的主要原因有哪些？(1)TaqDNA聚合酶失活。(2)引物出现质量问题。(3)Mg2浓度过低。(4)变性时的温度低，变性时间短。探讨点2.出现非特异性扩增条带的主要原因有哪些？(1)模板DNA出现污染。(2)引物特异性不强或形成引物二聚体。(3)Mg2浓度过高。(4)复性时的温度过低等。探讨点3. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什
13、么？【提示】可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。探讨点4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。【提示】如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。【检测案】1D 解析DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。2B 解析PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，49号是转基因植
14、株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250500 bp，A正确；3号PCR结果包含250500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。3C4D 解析PCR反应需要高温使DNA变性解旋，所以复制过程中要用耐高温的DNA聚合酶，A正确；PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物，由于DNA的两条模板链反向平行，所以复制时需要两种引物，且PCR扩增区域由这两
15、种引物来决定，C正确；电泳时，DNA的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，D错误。5D 解析当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度约为800 bp的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生长度约为600 bp和200 bp的两种DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点的磷酸二酯键，D错误。6D解析电泳出现位置不等的几条条带，说明存在长短不一的DNA片段，鉴定的PCR产物不纯
16、净，D错误。7D 解析第二轮复制得到4个DNA分子，复制得到和，复制得到和，故得到各一个，B正确；第三轮复制得到8个DNA分子，复制得到和，复制得到和，复制得到和，复制得到和，故得到和各一个，和各两个，两个且等长，即2个X基因，C正确；第四轮复制得到16个DNA分子，复制得到和，复制得到和，两个复制得到两个和两个，两个复制得到两个和两个，两个复制得到四个，故第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个X基因，D错误。8C 解析PCR体外扩增需要DNA做模板，所以反应体系中模板DNA的量和纯度会影响PCR的成功与否，A正确；设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和GC含量，以保证引物能与目的基因的特定
17、序列识别，且不能出现引物内部或引物之间的碱基互补配对，B正确；TaqDNA聚合酶的浓度过低，则扩增效率较低，扩增产物减少，若引物过短，非特异性扩增产物增多，C错误；由于PCR扩增需要在引物的下游延伸子链，所以DNA聚合酶只能特异性的催化复制处于两个引物之间的DNA序列，即目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置，D正确。9A。 解析:带电 DNA分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相反的电极移动,B项错误。DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子大小、构象等有关外,还与凝胶的浓度有关,C项错误。凝胶中的 DNA分子需要经过染色,才能在波长为300 nm的紫外灯下被检测,D项错误。10. (1)提示:逆转录酶、热稳定DNA聚合酶、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。(2)提示: 方案一(检测新型冠状病毒抗原):将产生专一针对新型冠状病毒抗体的B细胞与骨髓瘤细胞整合,获得大量的单克隆抗体,并做成检测试剂盒用来检测新型冠状病毒。方案二(检测新型冠状病毒抗体):将新型冠状病毒的刺突蛋白基因整合到载体上,利用基因工程获得大量的刺突蛋白,并做成检测试剂盒用来检测(血浆中)新型冠状病毒的抗体。
