1、最新考纲1基因工程的诞生 2基因工程的原理及技术 3基因工程的应用 4蛋白质工程 实验：DNA的粗提取与鉴定考纲解读1基因工程的实质2基因工程操作的四步曲及其操作实例3基因工程在农业、医药生产、疾病诊断和治疗中的应用4蛋白质工程的一般操作过程知识点一基因工程的概念及基本工具议一议：限制酶主要存在于原核生物中，它有什么意义？知识点二基因工程的基本操作程序想一想：什么叫基因文库？建立基因文库有什么意义？看一看：某研究小组在利用基因工程改造棉花时，发现转入的目的基因始终不表达，其原因可能是什么？知识点三基因工程的应用想一想：基因治疗是针对什么样的病进行的？知识点四蛋白质工程质粒载体质粒是细菌拟核DN
2、A外的环状DNA小分子，可在细菌间转移。质粒是常用的转基因载体。病毒载体病毒很适合用于基因治疗。病毒的蛋白质外壳内能容纳多达7 500个碱基的DNA片段。当病毒侵染宿主细胞并在细胞内增殖时，也将重组DNA带入到细胞中。病毒已经多次用于基因治疗的临床实验。这种方法存在的问题是宿主对病毒的免疫反应。显微注射法DNA可以通过显微注射法转入动物细胞中。下图所示的是目的基因的多份拷贝正通过玻璃微型吸管注射到受精卵中。转基因小鼠和家畜都是利用这种方法产生的，但是成功率很低；只有2%3%的受精卵发育成转基因动物，在这些动物中只有一小部分表达了转入的基因。基因枪法这种方法是利用压缩气体产生的动力将包裹在金属颗
3、粒表面的外源DNA打入生物组织中。常用的金属颗粒有金粉粒子或钨粉粒子。一些细胞能像表达自身基因一样表达导入的外源DNA。学习笔记： 自我校对：DNA重组体外DNA重组转基因遗传特性生物类型生物产品限制酶(限制性核酸内切酶)某种特定核苷酸序列特定部位的磷酸二酯键黏性末端平末端DNA连接酶磷酸二酯键质粒小型双链环状DNA限制酶复制遗传标记基因噬菌体的衍生物编码蛋白质PCR技术启动子终止子农杆菌转化法显微注射法插入了目的基因转录出了mRNA抗病抗逆生长速度品质药物器官移植蛋白质蛋白质氨基酸脱氧核苷酸议一议：限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自己的目的。想一想：将含有某种生
4、物不同基因的许多DNA片段，导入受体细菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。建立基因文库，便于随时获取目的基因。看一看：构建基因表达载体时，可能没有加入启动子。想一想：基因治疗一般针对很难用一般药物进行治疗的由基因异常引起的遗传病。,基因工程的基本操作工具1与DNA分子相关的酶(1)几种酶的比较 种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸
5、二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子(2)限制酶与DNA连接酶的关系限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。DNA连接酶起作用时不需要模板。2载体(1)作用作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(2)具备的条件能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。具有特殊的标记基因，以便
6、进行筛选。(3)种类质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。噬菌体的衍生物。动植物病毒。提醒一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。本部分知识多以选择题的形式出现，并且与必修内容联系密切，也可在基因工程综合题中作为某一具体问题出现。【典例1】(2011浙江卷)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是()。A每个大
7、肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子解析将重组质粒导入大肠杆菌中并成功表达，说明大肠杆菌内至少含有一个重组质粒；每个重组质粒都含有目的基因ada，则该重组质粒至少含一个能被该限制性核酸内切酶切割的位点；限制性核酸内切酶具有特异性，种类不同，识别的位点不同，切割出的黏性末端也就不同，因此并不是每个位点都能插入ada；根据题干信息，导入重组质粒的大肠杆菌成功表达出腺苷酸脱氨酶，说明插入的ada至少表达出一个腺苷酸脱氨酶分子。答案C【训练1】下列有关基因工程中限制性核
8、酸内切酶的描述，错误的是()。A一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B限制性核酸内切酶的活性受温度影响C限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD限制性核酸内切酶可从原核生物中提取解析考查基因工程中工具酶的有关知识。限制性核酸内切酶的化学成分是蛋白质，它的活性受到温度和pH的影响；限制性核酸内切酶的特点是能识别双链DNA中特定的核苷酸序列，可在特定的位点进行切割，但不能识别和切割RNA；限制性核酸内切酶主要是从原核生物体内分离出来的。答案C【训练2】如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst 、Sma 、EcoR、Apa为四种限制性核酸内切酶。下
9、列说法错误的是()。A图示过程是基因工程的核心步骤B表达载体构建时需要用到限制酶 SmaC抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构解析图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶Pst、EcoR。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。答案B,基因工程操作程序及与蛋白质工程的比较基因工程技术生产凝乳酶的过程1基因工程的操作程序分析(1)目的基因的获取途径从自然界中已有的物种中分离
10、出来，如从基因组文库或cDNA文库中获取。人工合成目的基因常用的方法有反转录法和化学合成法。利用PCR技术扩增目的基因通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。(2)基因表达载体的构建提醒插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。(3)将目的基因导入受体细胞(转化)生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的D
11、NA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(4)目的基因的检测与鉴定类型检测内容方法结果显示分子检测导入检测目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交(DNA和DNA之间)杂交带转录检测目的基因是否转录出mRNA分子杂交(DNA和mRNA之间)杂交带翻译检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交杂交带个体水平检测包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同2.基因工程与蛋白质工程的比较项
12、目区别 与联系 蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系(1)蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程(2)基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造本部分知识是高考的重点内容，特别是江苏卷年年都考，理综试题也多有涉及，各省对本部分内容考查要求不同，复习中应引起关注。【典例2】(201
13、1安徽)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。(1)进行转基因操作前，需用_酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。(2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的_和_之间。(3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、_和_。(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以_，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换
14、。解析本题综合考查基因工程、细胞工程和PCR技术，意在考查考生对基础知识的理解。胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理可以将动物组织分解成单个细胞；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子、标记基因等，其中启动子和终止子有利于目的基因的表达，标记基因有利于目的基因的检测；PCR技术中需要原料(4种脱氧核苷酸)、缓冲液、模板DNA、引物和耐热DNA聚合酶等；在生物反应器中放入多孔的中空薄壁小玻璃珠的目的：一方面有利于细胞的贴壁生长，避免接触抑制；另一方面有利于气体交换。答案(1)胰蛋白(或胶原蛋白)(2)启动子终止子(3)对干扰素基因特异的DNA引物对TaqDNA聚合酶(4)扩大细胞贴壁生长的附着面积【训练3
15、】(2011南京二模)下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题。(1)若限制酶的识别序列和切点是GATC，限制酶识别序列和切点是GGATCC，那么在过程中，应用限制酶_切割质粒，用限制酶_切割抗虫基因。(2)将通过过程得到的大肠杆菌涂布在含有_的培养基上，若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。(3)要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为：_。经筛选分析，该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，该转基因植株自交产生的F1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的
16、_。(4)过程所用的现代生物技术称为_，从遗传学角度来看，据细胞通过过程，能形成棉植株的根本原因是细胞具有_。解析本题极易出错的部分有：在第(1)小题中没有看清目的基因插入的位置，从而不能确定用限制酶还是来切割质粒还是切割抗虫基因。第(3)小题检测抗虫性状在个体水平上是否表达，应该让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，这个地方也有出错的，主要没有看清是在哪个水平上进行检测的。在切割质粒时应遵循一个原则：不能同时将两个标记基因切开，至少保留一个，所以只能用酶切割，而从目的基因两侧碱基序列可知，只能用酶才得到含目的基因的DNA片段。如果导入了重组质粒，此时重组质粒中四环素抗性基因能正常表
17、达，而氨苄青霉素抗性基因已被破坏，所以涂布在含有四环素的培养基上，能够生长的话，说明导入了重组质粒(普通质粒)。如果把携带一个抗虫基因的DNA片段看作杂合子，可以认为是Aa，自交产生的F1中仍具有抗虫特性的植株占总数的比例为。把一个细胞培养成一个植株的技术称为植物组织培养。答案(1)(2)四环素(3)让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状(4)植物组织培养发育成完整个体的全部遗传物质选修三高考必考教材实验DNA的粗提取与鉴定1实验原理(1)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同 ，其中在物质的量浓度为0.14 mol/L时最低。(2)DNA不溶于酒精，但
18、是细胞中的一些有机物如蛋白质则溶于酒精，可以用酒精提纯。(3)DNA遇二苯胺(沸水浴)会与之反应呈现蓝色，可用来鉴定DNA分子。2实验流程取一定量的鸡血细胞液，注入到含有20 mL蒸馏水的烧杯中，快速搅拌，加速细胞的破裂。然后进行过滤。DNA主要存在于滤液中。将物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液加入到滤液中，并搅拌使之混合均匀，使DNA充分溶解。贴壁缓缓加入蒸馏水，并轻轻地用玻璃棒沿一个方向搅拌。调整NaCl溶液浓度为0.14 mol/L，析出DNA。过滤后，加入预冷的体积分数为95%的酒精，并用玻璃棒沿一个方向缓慢均匀地搅拌，析出DNA丝状物。取两支试管，各加入物质的量浓度为2 mo
19、l/L的NaCl溶液，将丝状物放入其中一支试管中，并用玻璃棒搅拌。向两支试管中分别加入二苯胺试剂，沸水中加热一段时间，待试管冷却后，看溶解有DNA的溶液是否变蓝。1做该实验时，不能用猪血代替鸡血，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能提取DNA。2制备鸡血细胞液时，要注意向鸡血中加柠檬酸钠，防止血液凝固。3涨破细胞的方法：向血细胞中加入蒸馏水，血细胞溶液的浓度大于蒸馏水的浓度，从而使血细胞大量吸水而涨破。不能用生理盐水：因为血细胞溶液的浓度与生理盐水的浓度相当，所以血细胞在生理盐水中不能吸收水分。4两次加入蒸馏水，第一次是为了使血细胞吸水涨破；第二次是为了降低氯化钠的浓度，有利于DNA的析
20、出。5两次析出DNA的方法：第一次是加入蒸馏水，降低氯化钠的浓度，促使DNA析出；第二次是加入冷却的酒精，因为DNA不溶于酒精溶液。6鉴定DNA时要用两支试管，其中不加DNA的试管起对照作用，该试管溶液不变色，另一支加有DNA的试管溶液变蓝色。提醒选材时注意选用细胞易破碎、DNA含量相对较高的生物组织；鉴定DNA的二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果。本实验为选修教材的唯一高考必考实验，命题多出现在江苏单科考卷中，但近年理综考试中也有所涉及，应引起关注。【典例】(2010江苏卷)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10
21、 g。剪碎后分成两组，一组置于20 、另一组置于20 条件下保存24 h。DNA粗提取：第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮状物。DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。材料保存温度花菜辣椒蒜黄20 20 (注：“”越多表示
22、蓝色越深)分析上述实验过程，回答下列问题：(1)该探究性实验的课题名称是_。(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少_。(3)根据实验结果，得出结论并分析。结论1：与20 相比，相同实验材料在20 条件下保存，DNA的提取量较多。结论2：_。针对结论1，请提出合理的解释：_。(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：_，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。解析本题主要考查DNA粗提取的相关知识，意在考查考生的实验与探究能力。如果DNA断裂，就不容易被提
23、取出来；温度主要是通过影响酶的活性来影响生理过程。粗提取得到的DNA中含有少量的蛋白质，可以通过氯仿的特殊功能来去除蛋白质，提高DNA纯度。答案(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响(2)DNA断裂(3)等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液【训练1】(2011江苏卷)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关叙述正确的是()。A用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物B调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可
24、以去除部分杂质C将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色D用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同解析用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L时，滤取析出物；将丝状物溶解在0.015 mol/L的NaCl中，加入二苯胺试剂，需沸水浴加热几分钟，才呈蓝色；用菜花替代鸡血为实验材料，需要对材料的细胞壁进行处理，调节NaCl溶液浓度改变不同物质在其中的溶解度，加入木瓜蛋白酶分解蛋白质都可以去除部分杂质，故B正确。答案B【训练2】下图为一生物工程的流程图，下列叙述错误的是()。A由d细胞形成杂种植株所使用技术的中心环节是形成愈伤组织B细胞a、b到细胞c反映出
25、细胞膜的结构特点，即具有一定的流动性C同一物种的体细胞杂交与两个不同品种有性杂交，所得后代染色体数不相同D若用图示过程制备治疗“SARS病毒”的单克隆抗体，则B淋巴细胞应来自正常人解析制备治疗“SARS病毒”的单克隆抗体时，所需的B淋巴细胞应是经“SARS病毒”免疫过的，所以B淋巴细胞应来自“非典患者”。答案D【训练3】(改编题)如图所示为“DNA粗提取”实验的相关操作步骤，其操作目的错误的是()。A是洗涤红细胞，去除血细胞表面的杂质B是稀释NaCl溶液至0.14 mol/L，析出DNAC是选用2 mol/L NaCl溶液溶解黏稠物中的DNAD是纯化DNA，去除溶于95%的酒精中的杂质解析本题
26、考查DNA的提取，意在考查考生的识图能力和分析比较能力。是让血细胞与蒸馏水混合而使血细胞处于低渗的环境中，细胞因大量吸水而最终破裂，并释放出DNA。答案A1(2011四川理综，5)北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是()。A过程获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序B将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白C过程构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在
27、及其完全表达解析将多个抗冻基因编码区相连成能表达的新基因，合成的蛋白质为新的蛋白质，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白，故选项B正确；过程是利用反转录法合成目的基因，由于没有非编码区和编码区中的内含子，不能用于比目鱼基因组测序；用作载体的质粒，必须具有标记基因才能便于检测和筛选；应用DNA探针技术，可检测转基因抗冻番茄中目的基因的存在和转录，但不能检测是否成功表达，故选项A、C、D错误。答案B2(2010全国，5)下列叙述符合基因工程概念的是()。AB淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C用紫外线照射青霉菌
28、，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上解析基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。所以B为基因工程，而A为动物细胞工程，C为诱变育种，D无人为因素不属于基因工程。答案B3(2010浙江理综，2)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是()。A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C将重组DNA分子导入烟草
29、原生质体D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞解析限制性核酸内切酶用于提取目的基因和切割载体，烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，不能用限制性核酸内切酶切割，A项错误；DNA连接酶可以连接具有相同黏性末端的目的基因和载体，B项正确；受体细胞可以是受精卵和体细胞，也可以是去除细胞壁的原生质体，C项正确；目的基因为抗除草剂基因，所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除草剂的能力，筛选时应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞，D项正确。答案A4(2010江苏卷)下列关于转基因植物的叙述，正确的是()。A转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中B转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加C动物
30、的生长激素基因转入植物后不能表达D如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题解析抗除草剂基因导入到油菜的染色体后则可以通过花粉传入环境中；转抗虫基因的植物可杀死无抗性昆虫，对昆虫的抗性具有选择作用，所以会导致昆虫群体抗性基因频率增加；转基因技术打破了生殖隔离，动物的生长激素基因转入植物后可以表达；来源于自然界的目的基因导入植物体后，可能破坏原有的基因结构，具有不确定性，外源基因也可能通过花粉传播，使其他植物成为“超级植物”等，所以转基因技术存在着安全性问题。答案A5(2009浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()。A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶
31、和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达解析载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞，但由于它和目的基因是相互独立的，并不能促进目的基因的表达。答案D6(2011江苏卷，33)请回答基因工程方面的有关问题。(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_。在第_轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)设计引物是PCR技术
32、关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。第1组：_；第2组：_。(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_。(4)用限制酶EcoR、Mbo单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1 000个碱基对)，请画出质粒上EcoR、Mbo的切割位点。解析(1)依据图解特点，第四轮循环产物中可以得到16个DNA分子，其中有16个含引物B的单链、15个含引物A的单链，以及一个不含引物A的模板链。从图解原DNA与引物A、B的比例关系分析，经三次复制后开始出现两条脱氧核苷酸链等
33、长的DNA片段。(2)比较第一组引物的碱基顺序，可以发现引物与引物有两对碱基能发生互补配对，形成局部双链结构而失效；而第二组引物中，引物折叠后会发生碱基互补配对而导致失效。(3)在PCR反应体系中，引物首先与模板DNA单链互补配对形成局部双链DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下将单个脱氧核苷酸依次连接到引物链上。(4)分析本小题中图解可知，用EcoR切割质粒只得到长度为14 kb的一个片段，说明该酶在质粒上只有1个切点；同理可以推测Mbo在质粒上有2个切点；由图中可以看出同时用两种限制酶切割时得到了3个片段，由此可以推测限制酶EcoR的切点在图中11.5 kb的DNA片段中。具体切割位点见答
34、案。答案(1)三(2)引物和引物局部发生碱基互补配对而失效引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上(4)见右图7(2010天津理综，7)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答问题。(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用_限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含_的培养基上进行。(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是_(填字母
35、代号)。A启动子 BtetR C复制原点 DampR(3)过程可采用的操作方法是_(填字母代号)。A农杆菌转化 B大肠杆菌转化C显微注射 D细胞融合(4)过程采用的生物技术是_。(5)对早期胚胎进行切割，经过程可获得多个新个体。这利用了细胞的_性。(6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用_(填字母代号)技术。A核酸分子杂交 B基因序列分析C抗原抗体杂交 DPCR解析(1)由图示可知：需用Hind和BamH限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因，因酶切后tetR四环素抗性基因结构被破坏而ampR氨苄青霉素抗性基因结构完好，故用含氨苄青霉素的选择培养基可筛选含有重组载体的大肠杆菌。(2)启动子是一段
36、特殊的DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可调控基因的特异性表达。(3)过程表示把重组载体导入受体细胞的过程，当受体细胞为动物细胞时，常采用显微注射法。(4)过程表示把早期胚胎移植到代孕母牛子宫的过程，属于胚胎移植技术。(5)经过程得到新个体是细胞全能性的体现。(6)人乳铁蛋白基因是否成功表达，关键看是否有其表达产物即人乳铁蛋白，可用抗原抗体杂交法检测该蛋白是否存在。答案(1)Hind和BamH氨苄青霉素(2)A(3)C(4)胚胎移植技术(5)全能(6)C8(2009上海卷)人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。(1)目的基因的获取方法通常包括_和
37、_。(2)上图表示从正常人和患者体内获取的P53基因的部分区域。与正常人相比，患者在该区域的碱基会发生改变，在上图中用方框圈出发生改变的碱基对，这种变异被称为_。(3)已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域(见上图)，那么正常人的会被切成_个片段，而患者的则被切割成长度为_对碱基和_对碱基的两种片段。(4)如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460个碱基对的四种片段，那么该人的基因型是_(以P表示正常基因，P表示异常基因)。解析本题主要考查基因工程相关知识。(1)目的基因的获取方法有直接分离和化学方法
38、人工合成两种；(2)仔细对比正常人与患者的基因序列可知是CG碱基对变为了TA碱基对，这种变化属于基因突变；(3)正常人P53基因有两个限制酶E的识别序列，完全切割后可产生三个片段，患者P53基因中有一个限制酶E的识别序列发生突变，且突变点位于识别位点内，这样患者就只有一个限制酶E的识别序列，切割后产生两个片段，分别为290170460对碱基，220对碱基；(4)正常人的P53基因经限制酶E完全切割后产生三个片段，290对碱基、170对碱基和220对碱基，患者产生两个片段460对碱基和220对碱基，则该人的基因型应为PP。答案(1)从细胞中分离通过化学方法人工合成(2)见下图基因碱基对的替换(基
39、因突变)(3)3460220(4)PP9(2009福建卷)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答下列问题。(1)构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶_，对_进行切割。(2)培养板中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有_，作为标记基因。(3)香蕉组织细胞具有_，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中、依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的_。解析本题考查基因工程的有关知识。(1)从图可看出，只有Pst、EcoR两种酶能保持抗病基因结构的完整性，所以构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶Pst、EcoR两种酶，对抗病基因的DNA和质粒进行切割。(2)卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有抗卡那霉素基因，以此作为标记基因。(3)香蕉组织细胞具有全能性，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中、依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的脱分化和再分化。答案(1)Pst、EcoR含抗病基因的DNA、质粒(2)抗卡那霉素基因(3)全能性脱分化、再分化
