1、专题二 微生物的培养与应用 课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1解释选择培养基；2阐明统计菌落数目、设置对照、土壤取样及稀释的方法；3掌握从土壤中分离分解尿素的微生物及进行平板计数的方法。一、研究思路1筛选菌株(1)Taq细菌能耐受93左右的高温，是美国微生物学家托马斯布鲁克于1966年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据它对_的要求，到_中去寻找。生存环境相应环境(2)选择培养基：允许_的微生物生长，同时_其他种类微生物生长的培养基。(3)选择分解尿素细菌的培养基特点：_是唯一氮源；按物理性质归类为_培养基。特定种类抑制或阻止尿素固体在选择培养基上生
2、长的微生物是否一定是所需要的微生物？为什么？提示：不一定。因为微生物的培养是一个非常复杂的过程，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。2统计菌落数目(1)测 定 微 生 物 数 量 的 常 用 方 法 有 _ 和_。(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目为了保证结果准确，一般设置_个平板，选择菌落数在_的平板进行计数，并取 _。统计的菌落数往往比活菌的实际数目_，因此，统计结果一般用_而不是_来表示。活菌计数法显微镜直接计数法多于330300平均数低菌落数活菌数3设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中_
3、对实验结果的影响，提高实验结果的_。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用_作为空白对照。对照实验是指除了_的条件外，其他条件都_的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。非测试因素可信度培养该种微生物的无菌培养基被测试相同二、实验设计 关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1土壤取样土壤微生物中70%80%为_，主要分布在距地表_的近_性土壤中。细菌38 cm中2样品的稀释样品的稀释程度将直接影响平板上生长的_。由于不同微生物在土壤中含量不同，因此分离不同的微生物要选用不同的稀释度范围，以保证获得_、适于计数的平板。一般来说
4、，细菌稀释度为_倍，放 线 菌 稀 释 度 为 _ 倍，真 菌 稀 释 度 为_倍。第一次实验时，可将稀释范围放宽些，以保证能从中选择出适于计数的平板。菌落数目菌落数在30300之间104、105、106103、104、105102、103、1043微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养_和培养_。细菌一般在_培养_d，放线菌一般在2528培养57 d，霉菌一般在_的温度下培养_d。在 菌 落 计 数 时，每 隔 24 h 统 计 一 次 菌 落 数 目。选 取_时的记录作为结果，以防止因_而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种
5、微生物表现出稳定的菌落特征。菌落的特征包括_等方面。温度时间303712252834菌落数目稳定培养时间不足形状、大小、隆起程度、颜色三、对分离得到的分解尿素细菌的鉴定 在对能分解尿素的细菌进行初步筛选后，还需要借助生物化学的方法对分离的菌种作进一步的鉴定。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_将尿素分解成了_。氨会使培养基的碱性_，pH_。因此，我们可以通过检测培养基_变化来判断该化学反应是否发生。在以_为唯一氮源的培养基中加入_指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变_，说明该细菌能够_。脲酶氨增强升高pH尿素酚红红分解尿素一、选择培养基 选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，
6、以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。1加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。2加入高浓度的食盐溶液可得到金黄色葡萄球菌。3如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。4当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。例如，石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离出能消除石油污染的微生物的目的。5改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。1在培养基中加入尿素(唯一氮源)，以分离出能分解尿素的
7、细菌，这种加入尿素的培养基在功能上属于()A选择培养基 B固体培养基C液体培养基D半固体培养基解析：选择培养基是从功能上对培养基进行分类的，B、C、D三项所述的培养基是根据培养基的物理状态进行分类的。题述培养基能分离出以尿素为唯一氮源的细菌，故是一种选择培养基。答案：A二、微生物数量测定1方法：稀释涂布平板法统计活菌数测定土壤中的细菌数，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板培养，测定放线菌一般选用103、104和105倍的稀释液进行平板培养，测定真菌一般用102、103和104倍的稀释液进行平板培养。实验时，每一浓度至少涂布3个平板，以增强实验的说服力和准确性。当样品的稀释度足够高
8、时，培养基表面生长的菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少个活菌。2计数规则选择菌落数在30300的平板进行计数计算方法：每克样品中的菌落数(CV)MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用稀释液的体积(mL)3显微镜直接计数法与稀释涂布平板法的比较显微镜直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法是将经过适当稀释的菌悬液放在血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的(0.1 mm3)，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物
9、总数目。由于此法计得的是活菌和死菌的总和，故又称为总菌计数法。此法的优点是直观、快速，但需要与血球计数板配套使用，且计数随机性大，所以对菌体数量不能做出较为宏观、全面的反映。平板菌落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大。由于是菌悬液涂布，所以比较均匀，能较好地反映菌落的疏密程度，重复性、平行性好，是经典的计数方法。但需要平板上长出菌落一段时间后才能计数，因此速度慢是最大的缺点。4实验设计注意事项(1)设置重复组。实验要有足够的次数，才能避免结果的偶然性，使结论更有说服力与准确性。如该实验中，可在每个稀释度下设置3个选择培养基平板；计数时在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，求平均值
10、。这样也可以为实验是否成功提供参考，如重复组结果不一致，则意味着操作有误，需要重新实验。(2)设置对照。对照的设置也会增加实验结果的可信度和说服力。如在该实验中，可在配制培养基时，准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基两种，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用，在相同的稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数应明显多于选择培养基的。另外，要设置空白对照，即在培养基中不加土样，如果空白对照的培养基上没有菌落生长，则说明培养基没有被杂菌污染。2用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A涂布了1个平板，
11、统计的菌落数是230B涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233解析：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B两项不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地用3个平板的计数值求平均值。答案：D选择培养基的特点和应用某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁
12、盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(“目的菌”)。实验的主要步骤如下。请分析回答问题：(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选_，这种培养基属于_培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的_，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是_。(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量_的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量_。(4)转为固体培养时，常采用_的方法接种，获得单菌落后继续筛选。(5)若要研究“目的菌”的生长规律，可将单个菌落进行液体培养，采用_的方法进行计数，以时间为横坐标，以_为纵坐标，绘制生长曲线。(6)实验结
13、束时，使用过的培养基应该进行_处理后，才能倒掉。解析：题干中首先说明了化合物A是有机物，后来在培养基中又增加了磷酸盐、镁盐以及微量元素，通过比较各培养瓶中化合物A的多少，选出“目的菌”，由此还可推断出“目的菌”所需碳源和氮源都来自化合物A，是异养型。获得“目的菌”后，再进行扩大培养，培养过程中及培养结束后注意灭菌。答案：(1)“目的菌”选择(2)化合物A 异养需氧型(3)减少 增加(4)平板划线(5)定期取样“目的菌”数目的对数(6)灭菌土壤中微生物的分离与计数探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数。实验原理 农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上
14、进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。材料用具 农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的大试管若干。无菌移液管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、酒精灯、恒温箱。方法步骤(1)倒平板。分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在_操作。(2)制备土壤稀释液。取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌移液管吸取上清液1 mL，转至9 mL无菌水的大试管中，依次稀释到107倍稀释度。为实现无菌操作，试管口和移液管应在离火焰_ cm处。(3)涂布。按照由107103稀
15、释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布_个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布_个平板。(4)培养。放入恒温箱内，在适宜温度条件下培养34 d。一般每隔_小时统计一次，选取_时的记录作为结果，这样可以防止_。(5)细菌的计数。当菌落数目稳定时，选取菌落数在_的平板进行计数。如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌落数是_。(稀释度是105)(6)预期结果。相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落数_(填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。理由是_。解析：考查微生物的分离及计数。要分离自生固氮菌，采用选择培养基分离的方法，缺乏氮源的培养基可用来分离自生固氮微生物
16、，而其他微生物因缺乏氮源不能生长。实验步骤一般是：配制无氮培养基灭菌倒平板系列稀释涂布平板培养观察并计数。实验中要注意无菌操作和设计对照等。答案：(1)酒精灯火焰旁(2)12(3)3 1(4)24 菌落数目稳定 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目(5)30300 5107(6)多于 无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存微生物分离实验中对照实验的设计：普通培养基中涂布样品稀释液，证明选择培养基具有选择作用。选择培养基中涂布无菌水，证明选择培养基未被杂菌污染。旁栏思考1想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。2为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/g)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。点击进入WORD链接谢谢观看！
