1、一、基因工程的概念二、限制性核酸内切酶“分子手术刀”1简称：限制性核酸内切酶又称限制酶。2来源：主要从原核生物中分离纯化出来。3作用(1)识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。(2)切割特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。4作用结果：产生黏性末端或平末端。三、DNA连接酶“分子缝合针”1作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，拼接成新的DNA分子。2种类 种类比较项目Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只能“缝合”具有互补的黏性末端的双链DNA片段既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端四、基因进入受体细胞的载
2、体“分子运输车”1种类(1)质粒：是一种很小的双链环状DNA分子。(2)其他载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒等。2特点(1)能够进行自我复制。(2)有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。(3)具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(4)对受体细胞无害。3作用结果将外源基因送入受体细胞。五、重组DNA分子的模拟操作1材料用具：剪刀代表EcoR ，透明胶条代表DNA连接酶。2.切割要点(1)先分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出GAATTC序列，并选GA之间作切口进行“切割”。(2)然后再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoR 相应的切口剪开。一、限制性核酸内切酶(限制酶)阅读教材
3、P45，分析图12、13，探究下列问题：1限制酶切割DNA分子时，其切割部位在哪里？具有怎样的作用特点？提示：(1)切割部位是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)作用特点：具有专一性。具体表现在两个方面：识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列；切割特定序列中的特定位点。可用于DNA的切割，获取目的基因和切割载体。2利用限制酶切割得到的是黏性末端或平末端，二者有什么区别？提示：(1)黏性末端：是限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开形成的，如图所示。(2)平末端：是限制酶在识别序列的中心轴线处切开形成的，如图所示。具有黏性末端的DNA片段能够通过互补碱基间的配对重新结合，而具有平末端
4、的DNA片段不容易结合。二、DNA连接酶阅读教材P5并观察分析图14，讨论下列问题：1DNA连接酶的作用目的是什么？作用于哪种化学键？提示：(1)作用目的：将切下的黏性末端或平末端重新拼接、缝合，形成新的DNA分子。(2)作用的化学键：磷酸二酯键。2根据图示分析：(1)图中a酶、b酶分别是哪种酶？提示：a是限制酶(或限制性核酸内切酶)；b是DNA连接酶。(2)两种酶在基因工程中有什么作用及应用。提示：作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接三、载体阅读教材P6，观察分析图15，探讨下列问题
5、：1具备什么条件的物质才能充当基因工程的载体？提示：载体必须具备的条件：(1)能在受体细胞内稳定保存并大量复制。(2)有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。(3)具有某些特殊标记基因，以便进行筛选。当然，载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。2联系主动运输中的载体，试从它们的化学本质和作用方面分析二者的不同。提示：(1)主动运输中的载体是位于细胞膜上的蛋白质，其作用是运输离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。(2)基因工程中的载体的化学本质是DNA，其作用是：携带目的基因进入受体细胞；利用载体在宿主细胞中的复制对目的基因进行大量复制。如图为DNA分子结构示意图，下列对该
6、图的描述正确的是()A的名称是胞嘧啶脱氧核苷酸B解旋酶作用的部位是C某限制性核酸内切酶可选择处作为切点DDNA连接酶可连接处断裂的化学键解析图中包含上一个脱氧核苷酸的磷酸和下一个脱氧核苷酸的五碳糖和碱基，不是一个脱氧核苷酸，A错误；限制性核酸内切酶的作用部位是磷酸二酯键，解旋酶的作用是解开DNA双链，作用部位是氢键，B、C错误；DNA连接酶可连接处断裂的磷酸二酯键，D正确。答案D 与DNA有关的几种酶的比较 项目种类 限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用结果形成黏性末端或平末端形成重组D
7、NA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是_，二者还具有其他共同点，如_，_(写出两条即可)。(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为_；可使用_把质粒和目的基因连接。(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为_，其作用是_。(4)下列常在基因工程中作为载体的是()A苏云金芽孢杆菌抗虫基因B土壤农杆菌环状RNA分子C大肠杆菌的质粒D动物细胞的染色体解析基因工程中的载体必须具备三个条件：能够在宿主细胞内稳定保存并大量复制；有多个限制酶切割位点；有标记基因便于筛选，如大
8、肠杆菌的质粒。用同一种限制酶切割质粒和目的基因得到相同的黏性末端，再用DNA连接酶把目的基因和质粒连接在一起。大肠杆菌的质粒是基因工程中最常用的载体，载体的本质为DNA，抗虫基因属于目的基因，不属于载体，染色体的主要成分为DNA和蛋白质，不属于载体。答案(1)DNA能够自我复制具有遗传效应(2)CGCGT ADNA连接酶(3)标记基因供重组DNA的鉴定和选择(4)C基因工程中的限制酶与载体(1)载体必须具备一个或多个限制酶的切割位点，但每种酶的切点最好只有一个。若用于切割载体的限制酶有多个切点，则切割后质粒可能会丢失某些片段，若丢失的片段含有复制起始点，则重组DNA分子进入受体细胞后便不能进行
9、自主复制。(2)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。课堂归纳网络构建填充：限制酶DNA连接酶基因进入受体细胞的载体磷酸二酯键质粒关键语句1基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。2不同生物基因能拼接在一起的理论基础是DNA分子都是由4种脱氧核苷酸构成的规则的双螺旋结构。3外源DNA导入受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。4限制酶的作用特点是识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割。5限制酶和DNA连接酶的作用部位都是两个核苷酸间的磷酸二酯键。6在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体的衍生物
10、、动植物病毒等。1科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术基因工程，实施该工程的最终目的是()A定向提取生物体的DNA分子B定向地对DNA分子进行人工“剪切”C在生物体外对DNA分子进行改造D定向地改造生物的遗传性状解析：选D基因工程的定义就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物，也就是定向地改造了生物的遗传性状。2下列关于限制酶的说法正确的是()A限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布B一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C不同的限制酶切割DN
11、A后都会形成黏性末端D限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键解析：选B限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，并不是广泛存在于各种生物中；一种限制酶能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA分子经限制酶切割会形成黏性末端和平末端两种。3下列有关DNA连接酶的叙述正确的是()催化具有相同的黏性末端的DNA片段之间连接催化具有不同的黏性末端的DNA片段之间连接催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成催化脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成ABC D解析：选CDNA连接酶催化相同(即互补)的黏性末端进行连接，而不是不同的黏性末端的任意连接。DN
12、A连接酶作用的部位是磷酸二酯键，不是氢键。4质粒是基因工程的常用载体，下列关于它的说法正确的是()A具有环状结构的染色体，能够携带目的基因B含蛋白质，从而能完成生命活动C是RNA，能够指导蛋白质的合成D能够自我复制，从而保持连续性解析：选D质粒存在于细菌和酵母菌等生物中，是一种很小的环状DNA分子，不是染色体；其上有标记基因，便于目的基因在受体细胞中检测。质粒在受体细胞中自主复制，或随受体细胞DNA复制而复制，进行目的基因的扩增和表达。5下列哪项不是基因工程中经常使用的载体()A细菌质粒 B噬菌体C动植物病毒 D细菌拟核DNA解析：选D载体能够在宿主细胞中复制并稳定地保存，并且具有多个限制酶切
13、点及某些标记基因。基因工程中常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。6如图为某基因工程中利用的质粒简图，小箭头所指分别为限制酶EcoR 、BamH 的酶切位点，ampR为青霉素(抗生素)抗性基因，tetR为四环素(抗生素)抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR 、BamH 在内的多种酶的酶切位点。据图回答下列问题：(1)在基因工程中常用的工具有三种：一是用于切割DNA分子的_；二是将目的基因与载体拼接的_；三是作为载体的质粒。(2)将含有目的基因的DNA与经特定的酶切后的载体(质粒)进行拼接形成重组DNA，理论上讲，重组DNA可能有“_”、“_
14、”、“_”三种，其中有效的(所需要的)重组DNA是_。因此需要对这些拼接产物进行分离提纯。(3)利用图示的质粒拼接形成的三种拼接产物(重组DNA)与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的拼接产物(重组DNA)是_。解析：(1)在基因工程中常用的工具酶有两种：一是用于切割DNA分子的限制酶，二是将目的基因与载体连接的DNA连接酶。(2)用同一种限制酶将含有目的基因的DNA和质粒分别切开，产生的黏性末端相同，进行拼接形成的重组DNA，理论上讲，可能有目的基因目的基因、目的基因载体和载体载体三种。其中人们所需要的重组DNA是目的基因载体。(3)由图可以看出两
15、种限制酶的酶切位点都在四环素抗性基因中，两种限制酶都能破坏四环素抗性基因，因此用该质粒拼接形成的三种拼接产物(重组DNA)与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的拼接产物应是载体载体(仍有抗性基因)。答案：(1)限制酶(限制性核酸内切酶)DNA连接酶(2)目的基因目的基因目的基因载体载体载体目的基因载体(3)载体载体 (时间：25分钟；满分：50分)一、选择题(每小题2分，共20分)1下列关于限制酶和DNA连接酶的理解，正确的是()A其化学本质都是蛋白质BDNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键C它们不能被反复使用D在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替
16、DNA连接酶解析：选A限制酶与DNA连接酶的化学本质都是蛋白质；DNA连接酶连接的是两个DNA片段间相邻两个核苷酸间的磷酸二酯键；酶在化学反应前后其数量、性质、功能均不发生改变，因此可以反复利用；DNA聚合酶是在细胞内DNA分子复制时发挥作用的，不能替代DNA连接酶。2下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是()A每一种限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列B限制酶的活性受温度影响C限制酶能识别和切割RNAD限制酶可从原核生物中提取解析：选C限制酶是切割DNA的工具，这类酶主要是从原核生物中分离纯化所得，其活性的大小受温度的影响。限制酶能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，
17、并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。3目前科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列哪一项不是这一先进技术的理论依据()A所有生物共用一套遗传密码B基因能控制蛋白质的合成C兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则D兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先解析：选D转基因生物体内的外源基因能够成功表达是建立在下列基础之上的：所有生物共用一套遗传密码；具有细胞结构的不同生物遗传物质的组成一样，即都是由四种脱氧核苷酸连接而成的长链，然后根据碱基互补配对原则组成双链；不同生物体内蛋白质的合成都要在核
18、糖体上完成，且都需经过转录和翻译过程。4作为基因的运输工具载体，必须具备的条件之一及理由是()A能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选解析：选A作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达，必须能够在宿主细胞内稳定地保存并大量复制，以便通过复制提供大量的目的基因；具有某些标记基因，是为了通过标记基因是否表达来判断目的基因是否进入了受体细胞，从而进行筛选受体细胞；具有多个限制酶切点，则是为了便于与外源基因连接。5下列所示的黏性末端是由
19、几种限制酶作用产生的()A1种 B2种C3种 D4种解析：选D读图知题目中给定的这4种黏性末端均不相同，由限制酶的专一性特点知这4种末端应由4种限制酶切割形成的。6限制酶是一种核酸切割酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。如图为四种限制酶BamH 、EcoR 、Hind 以及Bgl 的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列是什么() ABamH和EcoR末端互补序列为AATTBBamH和Hind 末端互补序列为GATCCEcoR和Hind 末端互补序列为AATTDBamH和Bgl 末端互补序列为GATC
20、解析：选D读图知BamH识别GGATCC且从G与G间切割；EcoR识别GAATTC且从G与A间切割；Hind 识别AAGCTT且从A与A间切割；Bgl 识别AGATCT且从A与G间切割。比较这4个脱氧核苷酸序列知，BamH与Bgl 切割的序列中有互补黏合部分，即GATC。7下列关于细菌质粒的叙述，正确的是()A所有的质粒都可以作为基因工程中的载体B是独立于细菌拟核DNA之外的双链DNA分子，不与蛋白质结合C质粒对侵入的宿主细胞都是无害的D细菌质粒的复制过程都是在宿主细胞内独立进行的解析：选B细菌质粒是独立于细菌拟核之外的细胞质DNA分子，侵入宿主细胞后有的可以独立地进行自我复制，有的则整合到宿
21、主细胞染色体DNA上，随着宿主细胞染色体DNA的复制而同步复制。质粒上可能含有抗生素、毒素基因，对宿主细胞产生破坏作用。8下列有关基因工程技术的叙述正确的是()ADNA重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体B所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C一般选用细菌作为重组质粒的受体细胞D只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达解析：选CDNA重组技术所用的工具酶有限制酶、DNA连接酶，一种限制酶只能识别某种特定的核苷酸序列；载体是基因的运输工具；目的基因进入受体细胞后，受体细胞表现出特定的性状，才说明目的基因完成了表达；基因工程的结果是让目的基因完成表达，生产出目的基因的产物，选择受体
22、细胞的重要条件就是能够快速繁殖。9据图所示，有关工具酶功能的叙述错误的是()A限制性核酸内切酶可以切断a处BDNA聚合酶可以连接a处C解旋酶可以使b处解开DDNA连接酶可以连接c处解析：选D限制性核酸内切酶切割DNA分子时破坏的是DNA链中的磷酸二酯键，如图a处。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键，因此，DNA聚合酶可以连接a处。解旋酶解开两个碱基对之间的氢键，即使b处解开。DNA连接酶连接的是两个相邻的脱氧核苷酸的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，如a处，而图示的c处连接的是同一个脱氧核苷酸的磷酸和脱氧核糖。10某线性DNA分子含有3 000个碱基对(
23、bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是()a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)1 600；1 100；300800；300A在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个Ba酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接Ca酶与b酶切断的化学键不相同D用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，序列会明显增多解析：选DA项，限制酶a切割为三段，有2个切割位点，其产物又被限制酶b切割，形成两种产物，即再被切割2次，有两个切割位点。B项，a酶与b酶切出的黏
24、性末端能相互连接。C项，两种限制酶切断的化学键都是磷酸二酯键。D项，经分析a酶与b酶的识别序列及切割位点，不难发现它们形成的黏性末端可以相互配对连接，但一旦连接后，形成的重组DNA中已不存在原来两种限制酶的识别序列，不能再被切割，可以保存下来，因此经过若干次循环操作后和序列会明显增多。二、非选择题(共30分)11(11分)如图为体外对DNA分子进行切割和拼接的示意图，请据图回答以下问题：(1)EcoR是一种_酶，其识别序列是_，切割位点是_与_之间的_键，切割产生的DNA片段末端形式为_。(2)将不同来源的DNA片段“缝合”起来，需要_酶或_酶。它们均属于_酶，作用是_。其中能“缝合”两个双链
25、DNA片段的平末端的酶是_。解析：图解表示EcoR将两个DNA分子在特定序列的特定位点切开并通过DNA连接酶进行拼接的过程。Ecoli DNA连接酶只能“缝合”两个互补的黏性末端，而T4DNA连接酶既可以“缝合”两个互补的黏性末端，也可以“缝合”平末端。答案：(1)限制性核酸内切GAATTC鸟嘌呤脱氧核苷酸(或G)腺嘌呤脱氧核苷酸(或A)磷酸二酯黏性末端(2)Ecoli DNA连接T4DNA连接DNA连接催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键，将两个双链DNA片段“缝合”起来T4DNA连接酶12(10分)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答
26、下列问题： (1)一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma 酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma 切割，原因是_。(4)与只使用EcoR 相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。(6)现使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，并经拼接获得的重组质粒进行再次酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1、图2中标示的酶切位点及
27、表中所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。采用BamH 和Hind 酶切，得到_种DNA片段。采用EcoR 和Hind 酶切，得到_种DNA片段。解析：(1)该质粒为环状DNA，经Sma 切割前，不含有游离的磷酸基团，经Sma 切割后形成平末端，含有2个游离的磷酸基团。(2)Sma 识别的是CCCGGG序列，在C与G之间切割，Sma 酶切位点越多，也就是CG碱基对越多，C与G之间的氢键(3个)比A与T之间的氢键(2个)数量多，其含量越多，质粒的热稳定性越高。(3)据图1可知，Sma 切割位点在抗生素抗性基因(标记基因)中，据图2可知，Sma 切割位点在目的基因中，因此使用Sma 切割会破坏质
28、粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因。(4)用同一种限制酶处理质粒和外源DNA，再用DNA连接酶连接时，住往会有三种连接形式：目的基因质粒、目的基因目的基因(环化)、质粒质粒(环化)，后两种是我们不需要的，因而要进行筛选。用两种限制酶处理质粒和外源DNA，因形成的末端不同可避免上述情况的发生。(5)连接质粒与目的基因的工具酶是DNA连接酶。(6)分析由BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，并经拼接获得的重组质粒，这两种酶的识别序列仍然完整存在，如再用BamH 和Hind 两种限制酶进行酶切时，可再度被切开，形成2种DNA片段；而EcoR 的识别序列在原质粒中存在并没有被破坏
29、，同时切下的目的基因中还存在1个EcoR 的识别序列，因此在重组质粒中存在2个EcoR 的识别序列，如用EcoR 和Hind 酶切，可得到3种DNA片段。答案：(1)0、2(2)高(3)Sma 会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)2313(9分)通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，如图表示了这一技术的基本过程，在该过程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是 GGATCC，请回答：(1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是_。人体蛋白质基因“插入”后连接到羊体
30、细胞染色体中时需要的酶是_。(2)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是_，“插入”时用的工具是_，其种类有_。解析：首先明确限制酶为“剪刀”，切取目的基因，DNA连接酶起“缝合”作用，载体会把目的基因导入受体细胞，然后结合问题组织答案。(1)“剪刀”为限制酶，“剪下”羊的蛋白质基因，使用DNA连接酶将其与载体结合。(2)由图示可知限制酶识别的序列为GGATCC，并且在G与G之间切开，而且形成的黏性末端为反向重复的，所以两个末端分别为G 与GATCCCCTAG C。(3)“插入”时是蛋白质基因与原有基因结合，原因是都为反向平行的双螺旋结构。“插入”时需要载体。答案：(1)限制酶DNA连接酶(2)G GATCC CCTAGG (3)基因的结构是相同的载体质粒、动植物病毒、噬菌体的衍生物
