1、第2课 微生物的培养与应用 考点一 微生物的实验室培养 【核心知识突破】1.培养基：(1)概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。营养物质(2)种类：液体培养基和_培养基，二者的区别是 是否添加_。(3)营养成分。主要营养物质：_、_、水和无机盐。其他条件：pH、_和氧气。固体 凝固剂 碳源 氮源 特殊营养 2.无菌技术：(1)目的：获得_。(2)关键：防止_的入侵。(3)常用方法：_和_。纯净的培养物 外来杂菌 灭菌 消毒(4)无菌技术的主要方法及适用对象(连一连)：3.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：(1)计算：依据配方比例，计算配制100mL的培养基 时，_的用量。
2、(2)称量：准确地称取_。各种成分 各种成分(5)倒平板：待培养基冷却至_左右时，在_ _倒平板。50 酒精灯 火焰附近 4.纯化大肠杆菌：(1)菌落：由_繁殖而来的肉眼可见的_ 群体。一个细胞 子细胞(2)主要方法及纯化原理：主要方法平板划线法稀释涂布平板法纯化原理通过接种环在琼脂 固体培养基的表面 _操作，将 聚集的菌种逐步稀 释分散到培养基表 面将菌液进行一系列 的_，稀 释度足够高时，聚 集在一起的微生物 将被分散成单个细 胞连续划线 梯度稀释 主要方法平板划线法稀释涂布平板法主要步骤 _操作系列稀释操作和涂布平板操作接种工具接种环_平板示 意图 平板划线 涂布器(3)平板划线操作中灼
3、烧接种环的目的：灼烧时间灼烧目的第一次划线前杀死接种环上原有的微生物，防止 _污染培养基第二次及以后 每次划线前杀死上次划线后接种环上残留的菌 种，使下次划线的菌种直接来源于 _最后一次划线后 杀死接种环上残存的菌种，避免细 菌_和_外来杂菌 上次划线的末端 污染环境 感染操作者(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析：获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？提示：获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法，获得图B效果的接种方法为平板划线法。某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？提示：最可能的
4、原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。接种操作为什么一定要在火焰附近进行？提示：火焰附近存在无菌区域。5.菌种的保藏方法：主要方法临时保藏法甘油管藏法保藏对象 频繁使用的菌种_的菌种方法步骤先接种到试管的 _培养基 上培养，然后放入 4 的冰箱中转入灭菌后的 _中，混匀 后放在-20 冷 冻箱中保存长期保藏 固体斜面 甘油 6.【教材易漏知识】选修1 P18“旁栏小资料”：微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？提示：不是。微生物的接种方法还包括斜面接种、穿刺接种等，其核心是防止
5、杂菌污染，保证培养物的纯度。【微点警示】微生物培养的“三点提醒”(1)培养基中营养物质的确定方法。自养型微生物所需的主要营养物质是无机物，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。(2)选择无菌技术的原则。考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒要好。考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。(3)纯化大肠杆菌的两种方法的异同。相同点：平板划线法和稀释涂布平板法都能获得单细胞菌落。不同点：平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板
6、法能对微生物计数。【秒判正误】1.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回 到零后，开启锅盖。()分析：高压灭菌加热结束后，让其自然冷却，当压力 表的压力降到零时打开排气阀。2.在配制培养基时，一般微生物除满足营养需求外，还应该考虑pH、氧气及特殊营养物质的要求。()分析：一般微生物需要一定的营养、氧气、pH及特殊 物质(如添加维生素)，但培养厌氧微生物时，培养基 不能与氧气接触。3.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基 溅到皿盖上。()分析：倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手 将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后 立即盖上培养皿皿盖。4.为了防止污染，接种环经火焰
7、灭菌后应趁热快速挑 取菌落。()分析：灼烧接种环之后，要冷却后才能挑取菌落，以 免温度太高杀死菌种。5.从有机废水中分离分解有机物的微生物时，接种后 的培养皿要放在光照培养箱中培养。()分析：接种后的培养皿应放在恒温培养箱中进行培 养，光照会影响温度等条件。6.筛选产乳糖酶的微生物时，宜用乳糖作为培养基中 的唯一碳源。()分析：在以乳糖为唯一碳源的培养基上，只有能产生 乳糖酶而利用乳糖的微生物才能生存。【命题案例研析】【典例】(2018全国卷)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液，在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养
8、基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_ _(答出两点即可)，氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有_ _(答出两点即可)。(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养。平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是_。该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_ _。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和14
9、9，取平均值133。乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是_。【审答技巧】(1)审题关键：理解形成“透明圈”的原因：淀粉遇碘变蓝，在培养基中加入碘液后呈现蓝色，能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解成麦芽糖后蓝色消失，菌落周围会出现透明圈。题干中关键信息不要忽略：乙同学统计的菌落数分别是“27、169和176”，“27”不在“30300”中，且与“169和176”重复组差距太大，意味着很可能操作有误，需要重新实验。(2)满分答题：分析原因要体现出因果关系：设问(3)第二空时在回答原因(原理)时，若直接答
10、“淀粉遇碘变蓝”或“菌落周围会出现透明圈”均不能得满分，分析原因时一定要分析透彻，体现出因果关系才能得满分。设问(2)在回答问题时，题目要求“答出两点即可”，设问(2)第一空若只答“碳源”或“无机盐”一点不能得满分，设问(2)第二空若只答“蛋白质”或“核酸”一点不能得满分，若只答“DNA”和“RNA”也不能得满分，回答问题时一定要根据题目要求完整答题。【解析】(1)链霉素属于抗生素，作用是抑制细菌的生长。可以通过加入链霉素筛选出抗链霉素的细菌，属于选择培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有碳源、无机盐、有机盐、生长因子等，氮源进入细胞后，
11、可参与合成的生物大分子有蛋白质、核酸等。(3)淀粉遇碘变蓝，所以应加入的显色剂是碘液。该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈。(4)正确稀释涂布平板，平板上的菌落数应为30300。而乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。答案：(1)细菌 选择(2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸(3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差【高考长句应答特训】(1)利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是什么？提示：恰当的稀释度是成功
12、统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。(2)从平板上的菌落数推测出每克样品中的活菌数的计算方法是什么？提示：(平均菌落数涂布的稀释液体积)稀释倍数。【方法规律】选择培养基的设计方法(1)营养缺陷型选择培养基：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长。(2)添加抑菌物质的选择培养基：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对非目的微生物产生的抑制作用选择目的菌。(3)特殊培养条件的选择培养基：改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等)。【考点题组诊断】角度一 微生物的培养 1.(201
13、6全国卷)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；制作无菌平板；设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；将各组平板置于37 恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分X通常是_。(2)步骤中，实验组的操作是_ _。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调
14、查中出现了_现象。若将30(即36-6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_(填“正确”或“不正确”)。【解题指南】解答本题需要注意两点：(1)明确培养基中营养成分的来源。(2)理解实验目的与实验操作的对应关系。【解析】本题主要考查微生物培养。(1)微生物的生长需要碳源、氮源等营养物质，培养基中的牛肉膏、蛋白胨为微生物的生长既提供了碳源，也提供了氮源。微生物培养通常采用的培养基是固体培养基，故题中X应是琼脂，在培养基中起凝固剂的作用。(2)本实验的目的是了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况，应选择在不同的高度放置平板，使之暴露在空气中一段时间，以利于空气中微生物的沉降。(3)空白对照实
15、验组不应出现菌落。出现了菌落说明在此次实验中平板被污染。用实验组获取的菌落数的平均值减去污染产生的菌落数作为实验的结果，这种做法不正确，应在防止污染的情况下重新实验，以获得较准确的数据。答案：(1)牛肉膏、蛋白胨 琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(3)污染 不正确【方法技巧】判断培养基制作与接种操作是否合格的方法(1)从培养基制作是否合格上判断：如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。(2)从接种操作是否符合无菌要求上判断：如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合接种菌菌落的特点，
16、说明接种操作是符合要求的。如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作未达到要求，需要分析原因，重新操作。2.(2017江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：世纪金榜导学号(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有_ _。(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐_，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步_，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加_
17、。(3)下图为连续划线法示意图，在图中_(填图中序号)区域更易获得单菌落。(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中15 号比色管的苯酚浓度应分别为_。管号 1 2 3 4 5 6 苯酚浓度(mg/L)1 如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释_(填序号：5 10 20)倍后，再进行比色。【解析】(1)蛋白胨和苯酚都是含碳有机物，可以为酚 降解菌提供碳源。(2)将采集到的样品接种培养，随转 接次数增加而逐渐增加苯酚用量可以增大酚降解菌的 比例，以达到富集酚降解菌的目的。如果图中平板中 菌落
18、过于密集，说明培养液中酚降解菌数量过多，需 要进一步稀释后再涂布，以便于菌落计数与分离。平 板培养基是固体培养基，在配制的时候除了需要水、营养物质外，还必须添加琼脂等凝固剂。(3)因为每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，所以最后一次划线结束的时候更容易获得单菌落。(4)根据表中6号管中苯酚浓度为1 mg/L，可推知15号管中苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L。根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后苯酚残留液浓度在01 mg/L，需将残留液稀释20倍。答案：(1)蛋白胨、苯酚(2)增加 稀
19、释涂布 凝固剂(3)(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8 角度二 无菌技术 3.(2018全国卷)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_ _。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_。在照射前，适量喷洒_ _，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过_(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达
20、到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是_。【解析】(1)玻璃和金属材质的实验器具可以通过干热灭菌的方法来灭菌。(2)巴氏消毒法是在7075 煮30 min或在80 下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并使牛奶的营养成分不被破坏；高温瞬时消毒是在较短的时间内利用高温杀死微生物，由于时间较短，营养物质损失较少。(3)紫外线有消毒、灭菌的作用，在照射前，适量喷洒消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水消毒通常采用“氯气”或“紫外线”等方法。(5)使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，但没有达到相应温度，最可能的原因是锅内冷空气没有排尽。答案：(1)可以(2)在达到消毒目的的同时
21、，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构 消毒液(4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽 4.(2018江苏高考)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题：(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的_，及时对培养基进行分装，并进行_灭菌。(2)取步骤中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤中将温度约_(在25、50 或80 中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。(3
22、)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤所示进行划线。下列叙述合理的有_。a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌 b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落 c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量 d.可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株 (4)步骤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用2516型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上_色细胞的个数应不少于_，才能达到每毫升3109个活细胞的预期密度。【解析】(1)不同种微生物生长所需
23、的最适pH不同，所以，配制培养基时，溶化后需调pH。分装到试管中的培养基需进行高压蒸汽灭菌。(2)倒平板时，锥形瓶中的培养基温度控制在50 左右较适宜，温度太低会凝固，太高会烫手。(3)挑取分离平板中长出的单菌落用于平板划线时需注意题干中a、b、d所叙述的要点，为了获得专一酵母，只挑取效果最好的菌落就行，不需挑取多个菌落。(4)酵母在有氧条件下繁殖快，所以除了营养物质外，还需提供充足的氧气。对于死酵母通常用台盼蓝进行染色，活酵母不会被染色。设5个中格中应有m个，据题意可得到等式：m5104103=3109，m=60个。但由于用等体积的台盼蓝染液进行了染色，也被染液稀释了一倍，所以无色酵母数应不
24、低于30个。答案：(1)pH 高压蒸汽(湿热)(2)50 (3)a、b、d(4)氧气 无 30【加固训练】1.(2018石家庄模拟)牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：(1)巴氏消毒的方法是_，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是_。(2)取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是_。(3)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶
25、中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？_。(4)从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入_，菌落具有_特征的可以认定为大肠杆菌。【解析】(1)采用巴氏消毒法加工牛奶，在7075 煮30 min 或80 煮15 min进行杀菌，此种方法在杀灭牛奶中有害微生物的同时牛奶的营养成分不被破坏，完好地保存了营养物质和纯正口感。(2)取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择涂布器。(3)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用稀释涂布平板法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应减少稀释次数。(4)欲检测大肠杆菌，可在培养基中加入伊红
26、美蓝，大肠杆菌菌落会呈黑色，略带金属光泽。答案：(1)在7075 煮30 min(在80 煮15 min)牛奶的营养成分不被破坏(2)涂布器(3)减少稀释次数(4)伊红美蓝(金属光泽的紫)黑色 2.(2018揭阳模拟)炭疽杆菌能引起人畜患炭疽病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的寄主专一性，通过实验进行确诊。细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。细菌鉴定：实验流程图如图所示。(1)培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是_。(2)挑选可疑菌落制片后，用_观察，可看到呈竹节状排列的炭疽杆菌。(3)接种可疑菌后，35培养24小时，液
27、体培养基变浑浊，原因是_。图中的对照组试管中应加入_。两组试管同时培养6小时后，进行比较，若实验组液体培养基的浑浊度_(填“提高”“降低”或“不变”)，则可明确炭疽病疑似患者被炭疽杆菌感染。此实验依据的原理是_ _。【解析】(1)在配制培养基时，需要先调节pH，后灭菌。(2)菌落可以通过肉眼观察，而单个细菌无法通过肉眼观察，需要借助显微镜观察。(3)接种可疑菌后，35 培养24小时，液体培养基变浑浊，原因是细菌大量繁殖；对照组试管中应加入等量的生理盐水，与实验组同时培养6小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组低，则可明确炭疽病疑似患者被炭疽杆菌感染。噬菌体的宿主具有专一性，实验组加入的噬菌
28、体会侵染炭疽杆菌，使炭疽杆菌裂解，细菌数量减少，溶液浑浊度降低。答案：(1)先调节pH，后灭菌(2)显微镜(3)细菌大量繁殖 等量生理盐水 降低 实验组中的噬菌体能特异性地侵染炭疽杆菌，使其死亡，溶液变澄清 考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【核心知识突破】1.筛选菌株：(1)寻找目的菌株的方法：根据它对_的要求，到相应的环境中去寻找。生存环境(2)实验室中微生物的筛选。方法：_有利于目的菌株生长的条件，同时 抑制或阻止其他微生物生长。实例：筛选尿素分解菌时使用以_为唯一氮源的 _培养基进行培养。人为提供 尿素 选择(3)选择培养基：在微生物学中，将允许_的 微生物生长，同时_其他种类
29、微生物生长的 培养基。特定种类 抑制或阻止 2.统计菌落数目：比较 项目间接计数法(稀释涂布平板法)直接计数法(显微计数法)原理样品的稀释度足够高时，培 养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的_ _活菌，通过统计平板上 的菌落数，就能推测出样品 中大约含有多少活菌 利用特定_ _或_ _，在 显微镜下计算一 定容积的样品中 微生物的数量一 个 细菌 计数板 血细 胞计数板 比较 项目间接计数法(稀释涂布平板法)直接计数法(显微计数法)公式每克样品中的菌株数=_ C：某稀释度下平板上生长 的平均菌落数；V：涂布平 板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数每毫升原液所含细菌数：每小格平均
30、细菌数40010 000稀释倍数(CV)M 比较 项目间接计数法(稀释涂布平板法)直接计数法(显微计数法)缺点当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落不能区分细胞死活误差比实际值偏_比实际值偏_小 大 3.设置对照和重复：比较 项目对 照重 复目的 排除_对实验 结果的影响排除_ 对实验结果的影 响非测试因素 偶然因素 比较 项目对 照重 复方法空白对照：确定培养基制 作是否合格；条件对照：用_培养 基与选择培养基对照，说 明选择培养基具有选择作 用同一稀释度涂布 至少_个平板完全 3 4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：5.分解尿素的细菌的鉴别：(1)方法：在以尿素为唯一氮源
31、的培养基中加入_ 指示剂培养分解尿素的细菌。酚红(2)原理：(3)实验现象及结论。培养基变红：该种细菌_分解尿素。培养基不变红：该种细菌_分解尿素。能 不能【微点警示】关于“选择菌落数在30300的平板”的两个理解误区(1)只得到1个菌落数在30300的平板：不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。(2)得到3个或3个以上菌落数在30300的平板：也不一定正确，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30300”，但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大，应找出原因并重新实验。【秒判正误】1.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。()分析：脲酶是催化尿素分解的特异
32、性水解酶，只有能 合成脲酶的微生物才能分解尿素。2.筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一 氮源。()分析：分解尿素的细菌能合成脲酶，脲酶能催化分解 尿素，所以筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基 中的唯一氮源。3.将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上分离分解 尿素的细菌，是否无菌操作影响较小。()分析：土壤浸出液中含有多种杂菌，所以利用选择培 养基筛选土壤浸出液中特定微生物时，不需要进行严 格的无菌操作。4.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌。()分析：细菌产生的脲酶将尿素分解生成氨，氨会使培 养基的碱性增强，pH升高，酚红指示剂变红。
33、【命题案例研析】【典例】(2017全国卷)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_ _，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_ _(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_ _(答出两点即可)。【审答技巧】(1)审题关键：题干
34、中关键信息不要忽略：“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”都含NH4NO3，有其他氮源，无法起到筛选的目的。理解分解尿素的原理：分解尿素的细菌能产生脲酶，分解尿素。(2)满分答题：分析原因要体现出因果关系：设问(1)第二空在回答原因时，若直接答“分解尿素的细菌是异养生物”不能得满分；设问(2)第二空在回答原因时，若直接答“都含NH4NO3”不能得满分，分析原因时一定要分析透彻，体现出因果关系才能得满分。回答问题时根据题目要求答题：设问(1)第三空、设问(3)在回答问题时，题目要求“答出两点即可”，设问(1)第三空若只答“提供能量”或“提供原材料”一点不能得满分，设问(3)若只答“提供无机营养
35、”或“作为缓冲剂”一点不能得满分，回答问题时一定要根据题目要求完整答题。【解析】本题主要考查微生物的培养、筛选的相关知识。(1)有些细菌能分解尿素是因为这些细菌细胞内能产生脲酶，脲酶可将尿素分解成NH3和CO2。尿素是有机物，能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2合成有机物，只能利用现成的有机物。葡萄糖是生物的主要能源物质，细菌摄取葡萄糖作为碳源，可为生命活动提供能量，还可为其他有机物的合成提供原材料。(2)筛选不同的细菌所用的培养基是选择培养基，筛选能分解尿素的细菌，可用尿素作氮源，不能分解尿素的细菌会因氮源缺乏而死亡，能存活的只有能分解尿素的细菌。若选用NH4NO3 作氮源，无论是能分
36、解尿素的细菌还是不能分解尿素的细菌都可利用，起不到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4所含的元素是细菌生长需要的，同时这两种化合物也是缓冲物质，用于调节细菌培养过程中因代谢物生成后pH发生的改变，维持了细菌生活环境pH的相对稳定。答案：(1)脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原材料(2)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细菌生长过程中pH稳定【高考长句应答特训】(1)鉴定土壤中可分解尿素的细菌的方法及
37、原理是什么？提示：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，使酚红指示剂变红色。(2)农业生产中施用氮肥时，适当添加经上述筛选获得的菌种可以提高农作物的产量，原因是什么？提示：尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的尿素分解菌产生的脲酶将尿素分解成氨后，才能被植物吸收利用。【考点题组诊断】角度一 微生物的选择培养 1.(2015全国卷节选)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用_染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用_(填“萃取
38、法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以_为碳源的固体培养基进行培养。(3)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35、40、45 温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，_条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕_设计后续实验。【解析】(1)脂肪可被苏丹()染液染成橘黄色(红色)，题干中说明微生物A产生的油脂不易挥发，则可以采用萃取法提取微生物A中的油脂。(2)油脂为有机化合物，富含碳元素，故为了从自然界
39、获得能够分解油脂的单菌落，应以油脂为唯一碳源来配制培养基。在该培养基上，能分解油脂的微生物可以正常生长，其他微生物不能正常生长。(3)在45 下，降解10 g油脂所需酶量最多，则该温度下酶活性最低；由题干信息可知，40 下降解10 g油脂所需的酶量最少。应围绕40 设置不同温度梯度来探究酶的最适温度。答案：(1)苏丹(或苏丹)萃取法(2)油脂(其他合理答案也可)(3)45 40 角度二 微生物的计数 2.(2019武汉模拟)农业生产上有一种广泛使用的除草剂在土壤中不易被降解，长期使用会污染土壤。为修复被污染的土壤，可按图示程序选育出能降解该除草剂的细菌。已知该除草剂(含氮有机物)在水中溶解度低
40、，含一定量该除草剂的培养基不透明。请分析回答：世纪金榜导学号(1)微生物接种是微生物学研究中最常用的基本操作技术，该技术的核心是_。(2)在选育过程中，应将土壤浸出液接种于以该除草剂为唯一_的培养基上。通过比较单菌落周围_的大小，可筛选出高效的目的菌。实验结果如上图显示的AE五种菌株中，_是最理想菌株。(3)若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是_。将1 mL土壤溶液分别稀释10倍和100倍，每种稀释度各在3个平板上分别接入 0.1 mL稀释液，经过适当培养后，6个平板上的菌落数分别为59、57、58和2、7、5，空白对照组的平板上没有菌落，则每升土壤溶液中活菌数的理论值
41、为_个。(4)科研人员用放射线处理该细菌，获得突变株A和B，然后对突变株A和B进行实验，结果如表所示：接种的 菌种 一般培 养基 实验处理及结果 A 不生长 添加营养物质甲，能生长 B 不生长 添加营养物质乙，能生长 A+B 能生长 不添加营养物质甲、乙，能生长 请分析突变株A和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因：_ _。【解析】(1)微生物接种技术的核心是防止杂菌污染(无菌操作)。(2)已知该除草剂为含氮有机物，在水中 溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明；降解 该除草剂的细菌能分解培养基中的该除草剂，使培养 基中出现透明圈。可见，在选育能降解该除草剂的细 菌的过程中，应将
42、土壤浸出液接种于以该除草剂为唯 一氮源的培养基上。通过比较单菌落周围透明圈的 大小，可筛选出高效的目的菌。实验结果图显示的A E五种菌株中，E菌落周围的透明圈最大，因此E是最理 想菌株。(3)对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计 数，可采用稀释涂布平板法进行接种。统计菌落数目 时，一般选择菌落数在30300的平板进行计数，因此 应选择稀释度为10倍的、分别接入0.1 mL稀释液的3个 平板上的菌落数(分别为59、57、58)进行统计，则每 升土壤溶液中活菌数的理论值为(59+57+58)310(0.110-3)=5.8106(个)。(4)分析表中信息可知：突变株A生长需要营养物质甲，突变株B生长
43、需要营养物质乙，据此可推知，突变株A和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因是：突变株A生长需要营养物质甲，突变株B可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株A可以提供。答案：(1)防止杂菌污染(无菌操作)(2)氮源 透明圈 E(3)稀释涂布平板法 5.8106(4)突变株A生长需要营养物质甲，突变株B可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株A可以提供 3.(教材素材新命题选修1 P23图2-7改编)某研究小组的同学用所学的微生物的实验室培养的方法进行“变质牛奶中金黄色葡萄球菌的分离和计数实验”，部分实验处理和结果如图所示(注：培养皿旁的数字代表菌落数目；实验条件适宜；实验操作
44、规范等)。请回答相关问题：(1)在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的_和_条件；另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。(2)由样品到4号试管的操作中，第一步，将分别盛有 9 mL生理盐水的4支试管_，并编号14号；第二步，用移液管从样品中吸取1 mL牛奶，注入1号试管中，充分摇匀；第三步，重复第二步操作，以此类推。4号试管的稀释倍数是_。(3)资料显示，金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%15%NaCl肉汤中生长。本实验可配制含10%NaCl的培养基，使之成为_培养基，以利于金黄色葡萄球菌生长，抑制或阻止其他微生物的生长。(4)在统计菌落数目时，需要按照菌落计数的
45、要求计数，以保证计数结果准确。据图可得出1 mL牛奶样品中金黄色葡萄球菌的活菌数为_个。【解析】(1)在实验室培养微生物，既要为微生物提供 营养和适宜温度等环境条件，还要防止被其他微生物 污染。(2)图示中每一次稀释都稀释了10倍，因此4号 试管的稀释倍数为104倍。(3)含有10%NaCl的培养基属 于选择培养基。(4)图示中在2号试管和4号试管稀释度 下各有2个和1个培养皿，偶然性较大，应以3号试管 稀释度的数据进行计算，即(32+39+37)30.1103=3.6105(个)。答案：(1)营养 环境(2)灭菌 104(3)选择(4)3.6105 考点三 分解纤维素的微生物的分离 【核心知
46、识突破】1.纤维素与纤维素酶：2.纤维素分解菌的筛选：3.实验流程：【微点警示】关于纤维素分解菌的筛选的“三点”提醒(1)纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并不只有纤维素，其中酵母膏和水解酪素也可作为碳源。(2)在纤维素分解菌的选择培养基上生长的也不只有纤维素分解菌。因此，选择培养后要进行鉴别培养，才能获得纤维素分解菌。(3)出现透明圈的菌落也不一定就是纤维素分解菌。【秒判正误】1.纤维素酶是一类酶，它是由C1酶、CX酶和葡萄糖苷 酶组成的。()分析：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括 三种组分：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。纤维素在这三 种酶共同作用下才能被分解成葡萄糖。2.在选择培养纤维
47、素分解菌的实验中，选择培养的目 的是增加纤维素分解菌的数量。()分析：选择培养的过程中，其他微生物不能在培养基 上生长，纤维素分解菌的数量会增加。3.土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培养”是必不可少的。()分析：土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培 养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来 确定。4.筛选纤维素分解菌可采用刚果红染色法，刚果红染 色后的培养基上透明圈越大，说明纤维素分解菌越 多。()分析：筛选纤维素分解菌可采用刚果红染色法，刚果 红染色后的培养基上透明圈越大，说明纤维素分解菌 越多。5.在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红染色 剂，若出现透明圈，则说明筛选到
48、分解纤维素的细 菌。()分析：刚果红染色剂能与纤维素形成红色复合物。分 解纤维素的细菌产生纤维素酶分解纤维素，在分解纤 维素的细菌的周围出现透明圈。6.分离纤维素分解菌的流程是：土壤取样选择培养 涂布到鉴别培养基上培养挑选产生透明圈的菌 落。()分析：分离纤维素分解菌的流程是：土壤取样选择 培养梯度稀释涂布到鉴别培养基上培养挑选 产生透明圈的菌落。【命题案例研析】【典例】(2016全国卷)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用_对泡菜滤液进行梯度稀释，
49、进行梯度稀释的理由是_ _。(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_和_。分离纯化时应挑选出_的菌落作为候选菌。(3)乳酸菌在-20 长期保存时，菌液中常需要加入一定量的_(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。【审答技巧】(1)审题关键：根据信息理解透明圈的形成：固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙，形成透明圈。分析梯度稀释的原因：将聚集在一起的乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单菌落。(2)满分答题：分析原因要体现出因果关系：设问(1)第二空在回答原因时，若直接答“乳酸菌的浓度高”不能得满分，分析原因时一定要分析透彻，体现出因果关系才
50、能得满分。回答问题时答案要全面严谨：设问(1)第一空回答时要答“无菌水”，而不能答“蒸馏水”“纯净水”或“自来水”等；设问(2)第三空回答时要答“具有透明圈”，而不能答“透明的”或“放光的”等。【解析】(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水梯度稀释泡菜滤液，这样既可避免杂菌污染，又可保证将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。(2)乳酸的积累会使培养液pH降低，影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢(无氧呼吸)过程中产生的乳酸，使碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的识别和分离。(3)加入甘油可降低培养液的凝固点，使培养基在低温下保持液体状态。答案：(1)无菌水 泡菜滤液
51、中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落(2)鉴别乳酸菌 中和产生的乳酸(或酸)具有透明圈(3)甘油【方法规律】目的微生物选择的“三种”方法(1)利用平板划线法或稀释涂布平板法接种在固体平板培养基上，根据目的微生物特定的菌落特征挑选目的微生物。(2)利用选择培养基直接筛选目的微生物。(3)利用鉴别培养基鉴别筛选目的微生物。【考点题组诊断】角度一 纤维素分解菌的筛选 1.(2014全国卷)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将_分解成_。(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，C
52、R可与纤维素形成_色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的_。(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：酵母膏 无机盐 淀粉 纤维 素粉 琼脂 CR 溶液 水 培养 基甲+-+培养 基乙+-+注：“+”表示有，“-”表示无。据表判断，培养基甲_(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_ _；培养基乙_(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_ _。【解题指南】(1)题干关键词：“纤维素酶”“刚果红”。(2)隐含信息：两种培养基中有琼脂的为固体培养基，无琼脂的
53、为液体培养基；淀粉是微生物的碳源，不含纤维素粉不能作为分离和鉴别纤维素分解菌实验的选择培养基。(3)关键知识：土壤中某些微生物的分解作用和筛选纤维素分解菌的方法。【解析】本题主要考查纤维素酶的作用、刚果红染色法、分离和鉴别纤维素分解菌的方法。(1)纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被纤维素酶分解为葡萄糖，如图：(2)刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，且培养基中不能添加淀粉。答案：(
54、1)纤维二糖 葡萄糖(2)红 透明圈(3)不能 液体培养基不能分离单菌落 不能 培养基乙中没有纤维素，不会形成CR-纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌 2.(金榜原创预测)纤维素酶在生物燃料制作、布料处理中起重要作用。目前，利用微生物提高纤维素酶产量是主要发展方向。如图1为用紫外线照射含有纤维素分解菌的土样，分离、培养，再检测各菌株的纤维素酶的产量。请回答下列相关问题：世纪金榜导学号(1)从自然界获取纤维素分解菌，采集土样时应选择_的环境。(2)经高压灭菌锅灭菌的培养基，需要冷却后才能用来倒平板。常用于估计培养基已冷却到50 左右的简便方法为_ _。(3)上述培养皿中的
55、培养基除含有水、无机盐、酵母膏、水解酪素和琼脂等外，还应有_，目的是筛选纤维素分解菌。(4)若用刚果红染色法比较纤维素分解菌产生纤维素酶的量的多少，可通过观察平板培养基上以纤维素分解菌为中心的透明圈(如图3)的大小来比较，其中与A1组对应的是图中的_。(5)若要保证图3透明圈中均为单个细胞形成的菌落，操作要求是_。【解析】(1)筛选纤维素分解菌时应从富含纤维素的环境中取样。(2)用手触摸盛有培养基的锥形瓶刚刚不烫手时的温度是50 左右。(3)筛选纤维素分解菌时需要使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基。(4)图3中，的透明圈最大，分解纤维素的能力最强，相当于图2中的A1组。(5)菌液稀释度足够高时
56、，纤维素分解菌可以分散成单个细胞，可以保证图3透明圈中均为单个细胞形成的菌落。答案：(1)富含纤维素(2)用手触摸盛有培养基的锥形瓶刚刚不烫手(3)纤维素(4)(5)菌液稀释度足够高，使纤维素分解菌分散成单个细胞 角度二 其他微生物的筛选 3.(2018全国卷)回答下列与酵母菌有关的问题：(1)分离培养酵母菌通常使用_(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用_灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是_。(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进_(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进_(填“菌
57、体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是_ _。【解析】(1)麦芽汁琼脂培养基含糖量高，更适合酵母菌培养；该培养基应采用高压蒸汽灭菌法灭菌；若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，进行有氧呼吸产生H2O和CO2，释放能量多，菌体增殖快；若进行厌氧培养，进行无氧呼吸，产生乙醇和CO2，释放能量少，菌体增殖慢。(3)制作面包时，在面粉中添加一定量的酵母菌，因酵母菌可以分解面粉中的葡萄糖，产生CO2，CO2是气
58、体，遇热膨胀而形成小孔，使得面包松软多孔。答案：(1)麦芽汁琼脂 高压蒸汽 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体(2)菌体快速增殖 乙醇产生(3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软 4.(2018长沙模拟)有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、_四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是_。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是_。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第
59、二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的失误操作有_ _。(3)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是 _，该实验设计是否合理？为什么？_ _。【解析】(1)微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。要分离出有降解苯磺隆能力的土壤中的某些微生物，为了排除其他碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是无菌接种环。据题意分析知，造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域的第一条线时未从第一区域末端开始。(3)根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分泌降解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件同图乙的空白对照。答案：(1)氮源和无机盐 只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖(2)接种环 接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始(3)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 不合理，缺少空白对照 答案速填：1固体培养基 2巴氏消毒法 3高压蒸汽灭菌法 4稀释涂布平板法 5计算称量溶化灭菌倒平板 6甘油管藏法 7鉴别培养基 8每克样品中的菌株数=(CV)M
